犀黃丸對大腸癌LoVo細胞基質金屬蛋白酶2，9蛋白表達的影響*

孫莉娜，孟靜巖，王 威，應森林，李 丹，馬佐英，賈彥燾

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

犀黃丸對大腸癌LoVo細胞基質金屬蛋白酶2，9蛋白表達的影響*

孫莉娜1，孟靜巖1，王 威1，應森林1，李 丹1，馬佐英1，賈彥燾2

（1.天津中醫藥大學，天津 300193；2.天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193）

[目的]研究犀黃丸含藥血清對大腸癌LoVo細胞中基質金屬蛋白酶-2,9（MMP-2，MMP-9）表達的影響及意義。[方法]應用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法，檢測犀黃丸含藥血清作用下LoVo細胞培養上清液中MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平。[結果]在犀黃丸含藥血清的干預下，LoVo細胞中MMP-2、MMP-9的蛋白分泌水平與空白對照組比較明顯下調，差異具有統計學意義（P<0.05）。[結論]犀黃丸可能通過抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達，達到抑制大腸癌轉移的作用。

LoVo細胞；犀黃丸；含藥血清；基質金屬蛋白酶-2，9

大腸癌（CRC）是結腸癌和直腸癌的總稱，為臨床常見的消化道惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發病率的第3位。隨著人們生活飲食水平的提高，其發病率呈逐年上升狀態，嚴重威脅著人類的健康。目前，手術仍為主要治療方法，但其根治性手術切除后5 a生存率僅為50%左右[1]，術后復發和轉移是導致患者死亡的重要原因。因此，深入研究和探討大腸癌轉移相關機制具有非常重要的意義。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅離子依賴性內肽酶，能降解細胞外基質中的多種蛋白質成分，是血管新生的重要環節[2]，在腫瘤的浸潤和轉移中占據重要地位，其中以MMP-2、MMP-9最為關鍵[3]。研究發現，結直腸癌中MMP-2、MMP-9呈現過表達，在結直腸癌的轉移進展中起重要作用，且MMP-2蛋白表達能作為結直腸癌淋巴結轉移的獨立預測指標[4]。

犀黃丸又名西黃丸，載于清·王維徳所著《外科證治全生集·卷四》，由牛黃、麝香、乳香、沒藥4味組成，具有清熱解毒、消痰軟堅、化瘀散結、消腫止痛之功[5]。實驗藥理學和臨床研究均提示，犀黃丸對各種腫瘤具有一定的治療作用，其抗癌譜廣且毒副作用小，是臨床上廣泛應用的抗腫瘤藥之一[6]。本實驗通過體外細胞培養，采用血清藥理學方法，研究犀黃丸干預大腸癌高轉移細胞株 LoVo細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達情況，探討犀黃丸干預大腸癌轉移可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品及主要試劑 犀黃丸為天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠生產。MMP-2，MMP-9酶聯免疫檢測試劑盒均為美國R&D公司產品，F12K培養基（北京邁晨科技有限公司），胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries），胰蛋白酶（美國Sigma公司），磷酸鹽緩沖液（PBS，北京中杉金橋生物技術有限公司）,青霉素、鏈霉素均為國產市售產品。

1.2 實驗動物和細胞 Wistar大鼠24只，體質量（210±10）g，雄性，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號：SGXK（津）2009-0001。人大腸癌LoVo細胞株，購于美國典型培養物保藏中心（ATCC），用含有10%FBS的F12K培養基培養。

1.3 含藥血清制備 Wistar大鼠藥物組采用前期細胞增殖抑制實驗結果最佳的相對高劑量用藥組（6倍7d組和6倍14d組）即以犀黃丸臨床6倍劑量換算為大鼠劑量3.24g/（kg·d），給予犀黃丸混懸液，每日2次，每次2mL，進行灌胃。設立相應空白對照組（空白7d、空白14d組），給予等劑量生理鹽水。按要求分別灌胃7、14d，末次給藥1h后，乙醚麻醉股動脈取血，分離血清，56℃、滅活30min，過濾除菌、分裝，-80℃保存備用。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養上清液的制備 10%FBS的F12K培養液、對數生長期的LoVo細胞，制成單細胞懸液。4.5×104個細胞/（mL·孔），接種于24孔培養板中，于5%CO2，37℃，飽和濕度的培養箱中培養24h后，10%含藥血清的F12K培養液作用48h，每組設3個復孔。收集培養上清液，分裝，凍存于-20℃中備用。使用前12 000g離心5min，取上清液即可檢測。

1.4.2 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測MMP-2、MMP-9 采用由美國R&D公司生產的MMP-2、MMP-9酶聯免疫檢測試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。用多功能微孔板分析儀在450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。繪制標準曲線，依據吸光度值，計算樣品相應蛋白濃度。

1.5 統計方法 所得數據采用SPSS18.0進行統計，用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

檢測結果顯示，人大腸癌LoVo細胞培養上清中，MMP-2、MMP-9蛋白在各組均有表達。藥物組MMP-2、MMP-9表達水平與各自空白對照組相比均有所下降；6倍7d組中MMP-2表達與其空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.05，見表1），6倍14d組與其空白對照組比較差異無統計學意義（P> 0.05）；6倍7d組和6倍14d組中MMP-9與各自空白對照組相比表達水平均表現顯著降低的趨勢（P<0.01，見表2）。兩空白對照組間差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

細胞外基質和基底膜是腫瘤生長、擴散的自然屏障，癌細胞對細胞外基質（ECM）的降解是癌癥轉移過程中的重要步驟。腫瘤細胞對細胞外基質的降解作用是通過產生或誘導產生蛋白酶類實現的[7]。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，實驗證實，隨著腫瘤TNM分期的增高、淋巴結轉移的發生，MMP-2、MMP-9的表達逐漸增高，腫瘤降解ECM基底膜的能力增強，侵襲性增加，發生轉移的可能性也增大[8]。已有大量研究發現，MMP-2和MMP-9的表達水平與胃癌、卵巢癌、肺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的發生、侵襲及淋巴結轉移密切相關[9]。

表1 犀黃丸含藥血清對LoVo細胞MMP-2的影響（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

表1 犀黃丸含藥血清對LoVo細胞MMP-2的影響（±s）Tab.1 Effect of Xihuang pills on the MMP-2 in LoVo cells（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

組別 A450 nm OD值 MMP-2濃度（μg/mL）6倍7d組 1.049±0.039 0.721±0.034*空白7d組 1.145±0.021 0.803±0.0186倍14d組 1.076±0.070 0.744±0.061空白14d組 1.130±0.071 0.791±0.062

表2 犀黃丸含藥血清對LoVo細胞MMP-9的影響（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

表2 犀黃丸含藥血清對LoVo細胞MMP-9的影響（±s）Tab.2 Effect of Xihuang pills on the MMP-9 in LoVo cells（±s）

注：與空白對照組比較，**P<0.01。

犀黃丸是治療乳巖、瘰疬、痰核、肺癰等的名方，方中牛黃芳香性寒，能清熱解毒，豁痰開竅，消腫止痛，輔以麝香辛通走竄，能通行十二經脈，具有開竅醒神，活血化瘀，消腫止痛之功。佐藥乳香、沒藥為常用藥對，合用可通經疏絡，活血行氣，消腫止痛。此方為清熱解毒，活血祛瘀，軟堅消腫之上品。現代藥理研究表明，犀黃丸可以起到抗炎，鎮痛，止血消腫和抗癌等作用。實驗發現，牛黃能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，以牛黃為主的中藥組方能明顯提高機體的免疫功能，減輕化療的毒副作用且不影響腫瘤對化療的反應[10]；麝香具有抑制腫瘤細胞生長、誘導癌細胞凋亡和影響癌基因、抑癌基因的表達[11]；乳香沒藥能抑制腫瘤細胞增殖并具有抗炎鎮痛的作用[12]。

本實驗應用血清藥理學方法，用犀黃丸含藥血清作用于人大腸癌LoVo細胞后，細胞上清液中的MMP-2和MMP-9的活性蛋白表達量下降，提示犀黃丸能夠降低LoVo細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平，可能是犀黃丸能夠抑制大腸癌轉移的作用機制之一。由于中藥含藥血清成分復雜，中藥復方在機體內循環起作用的機制尚在探索階段，因此犀黃丸含藥血清降低MMP-2及MMP-9蛋白表達水平的明確機制尚有待于進一步探討和研究。

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Effect of Xihuang pills on protein expressions of MMP-2 and MMP-9 in human colorectal carcinoma LoVo cell

SUN Li-na1,MENG Jing-yan1,WANG Wei1,YING Sen-lin1,LI Dan1,MA Zuo-ying1,JIA Yan-tao2
（1.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China; 2.The First Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the effect of Xihuang pills(medicine-contained serum)on the protein expressions of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in human colorectal carcinoma LoVo cell.[Methods]The enzyme-linked immunoassay(ELISA)was used to determine the expression of MMP-2 and MMP-9 in the culture solution of LoVo cell under the action of Xihuang pills.[Results]The expression of MMP-2 and MMP-9 in medication groups was significantly lower than those of control group (P<0.05).[Conclusion]Xihuang pill has a potent effect of reducing the expressions of MMP-2 and MMP-9.This mechanism may play an important role in the suppression of colorectal carcinoma metastasis.

LoVo cell；Xihuang pills；medicine-contained serum；matrix metalloproteinase-2,9

R285.5

A

1672-2-5 （2012）04-0378-03

2012-05-04）

國家自然科學基金項目（3087227）。

孫莉娜（1983-），女，2009級碩士研究生，主要從事中醫基礎理論及脾胃病中醫藥診療方法研究。

孟靜巖。