補充磷脂對大鼠腓腸肌鈍挫傷后腓腸肌氧自由基反應和脂質過氧化反應的影響

周 靜,董義俊,葛新發,李可峰,陳京來,董貴俊

(1.中國石油大學體育教學部,山東 青島 266555;2.47師預備役坦克團,吉林 四平 136500;3.山東體育學院,山東 濟南250102)

鈍挫傷是一種常見的運動損傷,在不同運動項目中占有很高的比例.在對抗性項目或者意外事故中,鈍挫傷具有更高的發生幾率,這通常會嚴重影響傷者的運動能力及運動壽命.鈍挫傷后,由于肌肉自身恢復速度較慢,且容易生成疤痕組織,因此如何預防疤痕組織生成,加快骨骼肌損傷修復的速度,一直是運動醫學領域研究熱點之一[1].鈍挫傷早期,細胞膜通透性增加,炎性細胞浸潤導致大量氧自由基生成,容易加重損傷的程度,如何防范鈍挫傷后自由基的產生是促進肌纖維再生的關鍵[2-4].磷脂作為細胞膜系統的基本成分,對生物膜的流動性、通透性和完整性起著重要的作用.補充磷脂可以增加細胞膜的流動性、韌性和變形能力,增強細胞膜的功能.因而,磷脂補充可能益于修復細胞膜損傷,加速鈍挫傷后損傷修復程度[5-6].

本研究通過對重物自由落體誘發的腓腸肌鈍挫傷后恢復過程的大鼠補充外源性磷脂,觀察鈍挫傷后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后大鼠骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量變化,探討補充磷脂后對大鼠鈍挫傷腓腸肌中氧自由基反應和脂質過氧化反應的影響.

1 材料與方法

1.1 動物分組及喂養方法

實驗動物采用雄性wistar大鼠132只,購自山大動物中心提供,體重140-160 g,分籠飼養,自由進食、飲水,適應性喂養3天,飼養條件為室溫(24±2)℃,相對濕度控制在(55±15)%.大豆磷脂飼料,由基礎飼料+10%大豆粉末磷脂(購自北京美亞斯磷脂技術有限公司)配制而成.隨機分四組,除安靜對照組6只外,其余每組42只.具體分組情況和喂養情況為:安靜對照組(CK)服用基礎飼料;補充磷脂對照組(PC)和鈍挫傷后自然愈合組(NH)服用添加大豆粉末磷脂的飼料;鈍挫傷后補充磷脂愈合組(PB).

1.2 重物擊打構建腓腸肌鈍挫傷模型

結合前期我們對于骨骼肌鈍挫傷的研究[7],將實驗大鼠經10 g/L硫噴妥鈉麻醉后,固體木制圓柱體下落導致右小腿內側面(其皮下為腓腸肌中段)一次打擊傷[7],打擊面的直徑為110 cm.下落物體的長度為20 cm,質量為620 g,從垂直40 cm高處落下,計算后重力為6108 N,動能為2143 J.骨骼肌鈍挫后,解剖證實鈍挫傷發生情況[8].

1.3 測定大鼠腓腸肌 SOD、CAT、GSH-Px及 MDA變化情況

鈍挫傷后12 h、24 h、2 d、10 d、17 d、30 d 后采用戊巴比妥鈉麻醉將腓腸肌整塊取出,在冰浴中用玻璃勻漿器勻漿組織,用漩渦混合儀震蕩30秒后冰浴放置5分鐘,使用200 ul的移液器將組織勻漿液轉移至EP管中;放入高速冷凍離心機14000 r/min、4℃離心30分鐘,將上清液轉移至新的EP管中,標記好后放入-70℃冰箱內備用.

SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法,CAT活性測定采用可見光法,GSH-Px活性測定采用谷胱甘肽氧化法,組織蛋白質濃度檢測采用考馬斯亮蘭法,標準蛋白為BSA.上述試劑盒購自南京建成,具體操作參照試劑盒說明書進行.吸光度利用美國BECKMAN公司生產的BU800紫外分光光度計測定.

1.4 統計學分析

數據統計采用SPSS12.0統計軟件進行分析,實驗數據均以平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異,P<0.01表示具有極顯著性差異.

2 實驗結果

2.1 不同組別大鼠腓腸肌SOD活性變化情況

大鼠腓腸肌鈍挫傷后,NH組SOD活性表現為先上升再回落的趨勢(圖1).鈍挫傷后12 h內,PB組SOD活性較CK和PC組顯著性上升(P<0.05),24 h后檢測發現顯著性消失,至2-10 d后,檢測發現PB組SOD活性與對照組出現極顯著性差異(P<0.01).而自然愈合組在損傷后12 h內,SOD活性與CK和PC組相比出現顯著性上升(P<0.05);隨著CK和PC組SOD活性的上升,至鈍挫傷后24 h,NH組與CK和PC組SOD活性之間未檢出顯著性差異;與此同時,鈍挫傷后2-10 d里,PB組大鼠腓腸肌SOD活性顯著高于NH組(P<0.01).鈍挫傷后第10 d,PB組大鼠腓腸肌SOD活性達到最高值并仍顯著性高于NH組、CK組及PC組.從第10d后,PB組SOD活性呈下降趨勢,但仍高于其他三組.由此可見,補充磷脂在鈍挫傷12 h內能提高大鼠腓腸肌SOD活性,同時能預防鈍挫傷后2-10天自然愈合組出現的SOD活性急劇下降的過程,從而能長時間提高鈍挫傷后腓腸肌SOD活性,有利于腓腸肌鈍挫傷后修復過程.

2.2 不同組別大鼠腓腸肌MDA含量變化情況

大鼠受到鈍挫傷后,PB及NH組中MDA含量在損傷后的2 d內,都表現出相對于對照組顯著性上升的趨勢,但是上升的比例有所不同.在鈍挫傷后12 h內,雖然頓挫組MDA含量出現上升,但未出現統計學意義(P>0.05);24 h后,PB及NH組MDA含量較CK和PC組出現顯著性升高(P<0.05),但兩組之間未出現顯著性差異(P>0.05);至損傷2 d后,PB組MDA含量顯著性高于對照組(P<0.01),同時顯著性高于PB組(P<0.05)說明自然愈合組內出現大量脂質過氧化反應,這種反應在PB組內得到有效遏制;損傷至10 d后,NH組MDA含量顯著性高于其他組(P<0.05),其他組內部未發現顯著性差異,說明補充磷脂能有效遏制鈍挫傷初期(2-10 d)所發生的脂質過氧化反應,有利于腓腸肌鈍挫傷后恢復.

圖1 不同組別大鼠鈍挫傷后腓腸肌SOD活性變化(n=6)

圖2 不同組別大鼠腓腸肌MDA含量變化(n=6)

2.3 不同組別大鼠腓腸肌CAT活性變化情況

大鼠鈍挫傷后CAT活性變化主要發生在鈍挫傷后24 h內.鈍挫傷后12 h內,腓腸肌中CAT活性明顯升高(P<0.01),這種趨勢在PB組和NH組表現一致,未發現顯著性差異;至損傷24 h,PB及NH組CAT活性繼續上升,與對照組比較表現出具有顯著性差異,但是二者之間仍未出現顯著性差異(P>0.05)說明,損傷早期(24 h之內),CAT活性會顯著性提高,說明鈍挫傷會導致活性氧代謝增強而使H2O2積累增加,從而導致細胞膜受到損害,加速細胞凋亡過程;補充磷脂組的CDK活性與自然愈合組并未表現出顯著性差異,說明CDK活性的升高,可能是機體自適應過程,補充磷脂對緩解活性氧的產生,消除H2O2積累作用不明顯.

圖3 不同組別大鼠腓腸肌CAT活性變化(n=6)

2.4 不同組別大鼠腓腸肌GSH-Px活性變化情況

大鼠腓腸肌鈍挫傷后24 h內,PB及NH組GSH-Px活性較對照組出現上升趨勢,但統計學上未達到顯著性水平(P>0.05),同時PB組及NH組之間未出現顯著性差異(P>0.05);至損傷2 d后,NH組GSH-Px含量顯著性高于CK和PC組(P<0.05),PB組GSH-Px活性也顯著性提高(P<0.01);至損傷后10d,NH組和PB組GSH-Px活性極顯著性高于對照組(P<0.01),同時PB組顯著性高于 NH組(P<0.05).損傷10 d后,PB組與NH組GSH-Px含量逐漸下降,至損傷后30 d,恢復至對照組GSHPx活性水平.說明,損傷后補充磷脂從2 d起能顯著性加快自由基清除,至10 d能最大程度提高GSH-Px活性,至24d后逐漸恢復至對照組GSH-Px水平.

圖4 不同組別大鼠腓腸肌GSH-Px活性變化(n=6)

3 討論

大鼠骨骼肌急性鈍挫傷后,氧化應激反應主要發生在損傷部位,對于機體整體氧化及抗氧化水平影響未出現顯著性變化[8],因此本研究主要采用對大鼠鈍挫傷后取腓腸肌作為主要研究部位.大鼠腓腸肌鈍挫傷后,超氧離子由于"呼吸爆發"過程而大量產生,從而對大鼠腓腸肌肌細胞膜等產生進一步損傷[9].磷脂作為細胞膜雙分子層中重要的原料物質,能夠對生物膜的流動性、通透性和完整性起著重要作用,對骨骼肌運動疲勞等過程中自由基清除、細胞凋亡等具有積極意義[6,8,11].但是尚未發現對急性骨骼肌損傷修復過程中補充磷脂對自由基代謝的影響的相關報道.本研究旨在通過對大鼠腓腸肌鈍挫傷后修復過程中補充磷脂對SOD、MDA、CAT及GSH-Px等酶系統影響的研究,探討補充磷脂對于大鼠腓腸肌鈍挫傷后修復過程對于氧自由基反應和脂質過氧化反應的影響.

SOD是人體中一種比較重要的氧自由基清除劑,能將體內超氧自由基轉化為過氧化氫,參與人體抗氧化、抗疲勞、抗衰老等等重要生理過程[11],因此常被用作機體抗氧化能力的重要指標.本研究中,補充磷脂在鈍挫傷12 h內能提高大鼠腓腸肌SOD活性,同時能預防鈍挫傷后2-10天自然愈合組出現的SOD活性急劇下降的過程,從而能長時間提高鈍挫傷后腓腸肌SOD活性,有利于腓腸肌鈍挫傷后修復過程.因此,補充磷脂能在鈍挫傷后恢復的早期(2-10 d)顯著提高SOD在機體內的活性,延長機體抵抗氧自由基的能力,從而保護細胞膜免受氧自由基的破壞.

脂質過氧化過程中發生的活性氧物質(ROS)氧化生物膜的過程,即ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質起脂質過氧化反應形成脂質過氧化產物.MDA是ROS氧化的終產物,其含量可反映機體內脂質過氧化的程度及細胞損傷的程度[11].本研究中.PB及NH組中MDA含量在損傷后的2d內,都表現出相對于對照組顯著性上升的趨勢,但是上升的比例有所不同.至損傷2 d后,PB組MDA含量顯著性高于對照組(P<0.01),同時顯著性高于PB組(P<0.05)說明自然愈合組內出現大量脂質過氧化反應,這種反應在PB組內得到有效遏制.因此,補充磷脂能在鈍挫傷后2 d之內有效控制ROS引起的生物膜、膜受體相關的多不飽和脂肪酸及核算等大分子物質發生脂質過氧化反應,從而降低鈍挫傷造成的損害.

CAT是一種酶類清除劑,是生物防御體系的關鍵酶之一,存在于紅細胞及某些組織內的過氧化體中,它的主要作用就是催化H2O2分解為H2O與O2,使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應生成非常有害的-OH.研究發現,損傷后CAT活性上升主要集中在損傷后24 h之內,同時補充磷脂能促進CAT活性上升,但是與自然愈合組相比,未發現顯著性差異.

GSH-Px可以清除由活性氧和-OH誘發的脂質過氧化物,保護細胞膜結構和功能的完整性.大鼠腓腸肌鈍挫傷后24 h內,PB及NH組GSH-Px含量較對照組出現上升趨勢,說明損傷后24 h內,脂質過氧化水平上升;但是PB組和NH組間未發現顯著性差異,說明,損傷后24 h內補充磷脂未能顯著降低脂質過氧化水平;至損傷2 d至10 d,PB組GSH-Px活性顯著性高于對照組(P<0.01);至損傷后10 d,同時PB組顯著性高于NH組(P<0.05).說明,補充磷脂能從大鼠腓腸肌鈍挫傷2d后顯著性提高GSH-Px活性,從而加快脂質過氧化物清除,保護細胞膜完整性.

4 結論

與損傷后自然愈合組比較,補充磷脂能在大鼠腓腸肌鈍挫傷后恢復的2-10d,能顯著提高大鼠受損腓腸肌中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量,表明補充磷脂對于清除大鼠受損骨骼肌內氧自由基反應和脂質過氧化反應,加快消除損傷后發生的氧自由基,降低脂質過氧化水平,提高急性骨骼肌鈍挫傷恢復效果具有促進作用.

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