氯喹對大鼠全腦缺血／再灌注后學習能力的影響

陳 偉 崔桂云△ 王小鵬 趙秋宸 黃曉雷 花 放 沈 霞

1）徐州醫學院神經病學教研室 徐州醫學院附屬醫院神經科 徐州 221000 2）徐州醫學院臨床醫學系 徐州 221000

急性缺血性腦卒中是一種當前嚴重危害人類健康的疾病，占全部腦卒中患者的60%～80%。早期實現缺血區血流復灌是治療的關鍵，但在實現再灌注后有部分患者出現神經功能損傷加重，被稱為缺血／再灌注損傷，并往往帶來患者認知功能的損害。目前已證實缺血部位的炎癥反應參與缺血／再灌注損傷的病理生理機制［1－2］。氯喹可以通過下調免疫細胞產生炎性因子水平達到抗炎作用，現已有研究表明氯喹可以抑制腦缺血部位的炎癥反應，但對缺血后學習能力的影響尚未見報道，本實驗將探討這一問題。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組SD雄性清潔級大鼠，體質量250～300g，購自中國科學院上海動物中心，隨機分為假手術組（S組）、缺血／再灌注組（I／R組）與氯喹處理組（C組），每組12只。

1.2主要試劑及設備氯喹（美國sigma公司），HE染色試劑盒（碧云天生物技術研究所），Y型電迷宮由張家港生物醫學儀器廠生產。

1.3 SD大鼠全腦缺血模型的建立按Pulsineli方法制作大鼠四血管阻塞模型，實驗動物隨機分為假手術組、缺血／再灌注組（I／R）組和氯喹處理組。I／R組以10%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉后，分離雙側頸總動脈，掛線備用，然后電凝雙側椎動脈，術后第2天在大鼠清醒狀態下分離出雙側頸總動脈，動脈夾夾閉15min，再灌注72h后處死；假手術組處理同缺血／再灌注組，但不夾閉雙側頸總動脈；氯喹處理組處理同缺血／再灌注組，但在夾閉頸總動脈前2h腹腔注射氯喹（60mg／kg）。

1.4組織切片的準備假手術組大鼠在分離頸總動脈后72 h，缺血／再灌注組與氯喹處理組大鼠于再灌注72h時間點暴露心臟，經左心室插入導管至升主動脈，剪開右心耳，先快速灌注37℃生理鹽水100～150mL沖凈血液，再灌注4℃4%多聚甲醛固定液250mL，其中前1／3快速灌注，后2／3慢滴，共在30～40min內灌注完畢；然后斷頭取腦，以視交叉和乳頭體后緣為界線取包含海馬的腦組織放入4%多聚甲醛后固定48h，常規石蠟包埋，用切片機作連續腦冠狀切片（片厚6μm）。

1.5 HE染色步驟HE染色過程按照染色試劑盒提供的實驗步驟使用蘇木素及伊紅進行染色，光鏡下觀察海馬部組織結構及細胞形態。

1.6行為學檢測訓練及評定方法：Y型電迷宮，電刺激參數：電壓50～70V，電流強度017mA，電擊延時5s。（1）篩（預）選：將大鼠放入Y型迷宮箱中適應3～5min后，給予適當電擊，至其對3臂均探索進入為止，選擇活躍、對電擊反應較敏感、逃避反應迅速者供測試用。（2）學習記憶測試：采用固定次數隨機不休息法，以大鼠在足底通電后10s內一次性進入安全區的反應為正確，否則為錯誤反應。每次實驗對每只大鼠分別進行測試，連續10次測試中有9次或以上正確反應（行為正確率≥90% ）為達到學會標準，以每只大鼠達到學會標準所需次數表示大鼠的學習記憶成績，平均達標所需的次數越多，表示達到學會標準所需時間越長，則表明動物學習、記憶成績下降。各組在造模后72h分別予以Y型迷宮測試其學習記憶能力。

1.7統計學分析實驗數據均采用SPSS16.0統計分析軟件進行統計學處理數據以均數±標準差（s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果HE染色結果如圖1所示，假手術組大鼠海馬結構完整，細胞排列整齊緊密，細胞核完整。缺血／再灌注組大鼠海馬神經元排列雜亂，細胞結構崩解。氯喹處理組大鼠海馬雖然部分組織結構散亂，但整體損傷程度輕于損傷組大鼠。見圖A～圖F。

2.2行為學測定結果假手術組、缺血組、氯喹處理組Y迷宮測試達標次數分別為（34.33±5.57）次、（67.67±8.52）次、（55.5±6.22）次。結果顯示缺血／再灌注組大鼠達到學會標準次數明顯較正常組和氯喹處理組大鼠高（P＜0.05），氯喹處理組大鼠達到學會標準的次數高于假手術組大鼠（P＜0.05）。

3 討論

早期實現缺血區域的血流灌注是急性缺血性腦卒中的最有效治療措施，但缺血／再灌注損傷卻加重病情進展，其具體病理生理過程至今仍不明確。近年來缺血區域的炎癥反應引起研究人員的注意，免疫細胞的活化與募集［3］，各種炎性因子的釋放［4－5］都可以加重組織損傷。近年來氯喹作為免疫調節藥物被廣泛應用于自身免疫病的治療，在最新研究中證實氯喹能夠抑制溶酶體功能并協同性地激活糖皮質激素信號，進而通過激活的糖皮質激素信號進一步抑制炎癥基因轉錄，降低炎癥因子水平，從而實現抑制炎癥的目的［6］。現已明確氯喹可以抑制單核巨噬細胞系統產生腫瘤壞死因子α與白介素6［7－8］，而這兩種細胞因子恰恰是急性腦缺血損傷程度的重要標志，均可以加重腦缺血后的炎癥損傷。我們認為氯喹在血腦屏障被缺血性損傷破壞后，在腦內可達到較理想的血藥濃度并通過下調缺血區域炎性因子的水平抑制炎癥細胞的活化與浸潤，阻止了炎癥級聯反應的發生與發展，減輕了缺血區的二次損傷，保護了半暗帶區殘存神經細胞，有效改善預后。

海馬結構是腦內對缺血缺氧刺激尤為敏感的部位，同時也是腦內重要的參與學習與記憶能力形成的部位，本實驗中我們采用HE染色方法對海馬部進行染色觀察不同組大鼠海馬部的形態，結果表明氯喹處理組大鼠和缺血損傷組相比，海馬部細胞損傷情況明顯改善，細胞排列整齊且細胞結構完整。這提示在腦缺血模型中使用氯喹可能會在缺血腦組織中發揮其免疫調節作用，減輕了缺血組織的炎癥損傷，達到保護神經元的目的。我們進一步使用Y形電迷宮對各組大鼠學習及記憶能力進行測定，結果證明雖然氯喹處理組大鼠達標次數多于假手術組，但卻明顯少于缺血／再灌注損傷組大鼠。這一結果提示可能因為氯喹減輕腦組織損傷從而較為完好的保存認知功能。

本實驗通過對腦組織形態的觀察及對大鼠學習能力的測試，證實氯喹可以對大鼠腦缺血后學習能力的保留產生積極影響，這可能是由于在腦缺血后血腦屏障受到破壞，使氯喹可在腦內達到合適的血藥濃度，通過抑制海馬結構的炎癥反應進而減輕組織損傷，達到維持神經功能的作用。但氯喹在缺血再灌注損傷中的具體作用機制仍有待深入研究。

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