RNAi－chk1在抑制小鼠Lewis肺癌細胞生長作用的實驗研究

侯吉光，張 奇，王紅勇，賈曉晶，賈 杰

（1．吉林大學第二醫院 放療科，吉林 長春130041；2．吉林大學第二醫院腫瘤 生物治療科，吉林 長春130041；3．吉林大學中日聯誼醫院 電診科）

細胞周期檢測點激酶1（Chk1）是細胞周期檢測點（G1／S、S和G2／M）中非常重要的蛋白激酶，它們通過信號傳導和放大，調節下游靶蛋白表達，使細胞周期出現阻滯。抑制Chk1蛋白表達，可有效地消除腫瘤細胞在放射線或化療藥物作用后的細胞周期阻滯，抑制腫瘤放療、化療所導致的DNA損傷進行修復，從而增加放化療的敏感性［1，2］。由于阻斷劑技術本身存在諸多缺陷，這極大地限制其應用于臨床腫瘤治療［3，4］。而小片段干擾核糖核酸（small interferenceRNA，siRNA）技術能較好地解決應用阻斷劑所帶來的問題，從而可為腫瘤放射基因治療研究提供新途徑。本文在前期實驗基礎上應用chk1－536的RNAi載體轉染Lewis肺癌細胞株，觀察chk1－RNAi聯合放療對Lewis肺癌細胞株凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 TR Izol Raegent、脂質體 LipofectimineTM2000、DMEM 培養基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌細胞株，本室保存。pGPU6／GFP／Neo－chk1－536，本室在前期工作中已經成功構建、鑒定、篩選［5］。

1．2 方法

1．2．1 轉染Lewis肺癌細胞株 轉染前：2－3×106個細胞接種于6孔培養板中，37℃，5%CO2孵箱中培養過夜，使細胞達80%融合，此細胞密度為細胞轉染所必需。轉染前用不含抗生素的無血清培養基洗兩次，加0．8ml無血清且不含抗生素的培養基。轉染：取1μg質粒DNA，加無血清且不含抗生素的培養基至100μl，同時用無血清且不含抗生素的培養基將10μl LipofectamineTM2000稀釋至100μl，室溫孵育5min。將這兩種溶液緩慢混和，室溫孵育10－15min，將此混和物加到細胞上，緩慢混和。37℃，5%CO2孵箱中培養，轉染24、48、72h后分別收集Lewis肺癌細胞，待下一步檢測。

1．2．2 RT－PCR檢測chk1基因 TR Izol提取各組細胞總RNA，取1μg總RNA進行RT－PCR擴增。以 Parp1 的 引 物 Parp1p1：5＇－TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG－3＇、Parp1p2：5＇－CTTTGCCTGCCACGCCTCCAGCC－3＇進行 RT－PCR，擴增片段為210bp，檢測Parp1mRNA的表達情況。

以β－actin P1：5＇CGTTGCGTTGCTATCCAGGCTGTGCTA 3＇，β－actinP2：5＇CCAGGTCCAGACGCAGGATGGC 3＇為內參照，擴增片段為143bp。將PCR擴增產物在1．5%的瓊脂糖凝膠上電泳。收集chk1mRNA，進行RT－PCR檢測。

1．2．3 照射條件 采用Philips深部X射線治療機，電壓200kV，電流10mA，濾板0．5mm Cu和1．0mm Al。球靶距50cm，劑量率0．287Gy／min，總劑量為2Gy。將Lewis肺癌細胞含5×106個細胞／ml接種于25cm2底面積的培養瓶中。照射前一天更換新鮮培養基。照射后24h檢測chk1蛋白表達的變化。

1．2．4 實驗分組 空白對照組、錯義序列組、siRNA組，2Gy照射組、2Gy照射＋錯義序列組、2Gy照射＋siRNA組

1．2．5 MTT法檢測細胞抑制率 上述轉染細胞48h時，進行2Gy照射，24h后分別加入 MTT 10 μl，振蕩15min，酶標儀檢測吸光度（A）值。計算細胞抑制率，腫瘤細胞生長抑制率＝（1－A／B）×100%。

1．2．6 流式細胞術檢測轉染siRNA后細胞的凋亡各組細胞以1．5×105／L密度接種于25cm2培養瓶，以方法1轉染后繼續培養48h，進行2Gy照射，24 h后胰酶消化、離心收集并懸于PBS中，4℃、70%乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30min。應用流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

1．2．7 統計學方法 數據以均數±標準差（x—±s）表示，以SPSS 13．0統計軟件處理，采用方差分析作差異的顯著性分析，P＜0．05為差異具有顯著性意義。

2 結果

2．1 轉染細胞chk 1mRNA表達水平 各組210 bp處均可見清晰條帶，siRNA和2Gy照射組＋siRNA組條帶明顯減弱，各組內參照β－actin條帶一致，見圖2．1。

圖2．1 RT－PCR檢測轉染細胞的chk1的表達

2．2 siRNA對小鼠Lewis肺癌細胞生長的抑制pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536轉染組及2Gy照射組的吸光度值與空白對照組比，差異顯著（t＝4．262－7．183，P＜0．05）；2Gy照射組＋pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536組的吸光度值與2Gy照射組、pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536組比較差異有顯著意義（t＝4．149－5．957，P＜0．05）。2Gy照射組＋pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536組對Lewis肺癌細胞的抑制率最高，為63．3%。

2．3 siRNA對Lewis肺癌細胞凋亡的影響 pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536轉 染、2Gy 照 射 可 誘 導Lewis肺癌細胞凋亡，與正常對照組比，差異顯著（t＝3．586－3．75，P＜0．05），并且 pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536轉染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細胞凋亡（t＝2．674－2．838，P＜0．05）。

3 討論

當細胞受到放、化療損傷后，細胞可通過細胞周期檢測點信號傳導通路激活細胞的G0、S、G2／M各期的細胞周期檢測點，使受損的細胞停滯于各個細胞周期，并對受損的DNA進行修復，從而避免過多的細胞產生凋亡［6，7］。在細胞周期檢測點信號傳導通路中，細胞周期檢測點激酶（Chk1）起著重要作用。Chk1主要通過以下機制保護細胞的基因組免受外界因素的損傷：受損的DNA活化chk1，致使細胞阻滯在S期、G2／M期檢測點，受損的DNA得以修復，從而維持基因組的完整性；反之，若損傷廣泛無法修復時則會誘導凋亡［8］。近年來研究表明，通過特異性基因阻斷劑抑制腫瘤細胞DNA損傷修復過程中關鍵調控基因功能，可以抑制DNA修復，增強其放療效果。電離輻射誘導DNA損傷信號傳導途徑使檢查點G1／S和G2／M激活，延遲細胞周期進程，為DNA損傷修復爭取時間。

RNA干擾是一項強大的阻斷真核細胞中特異表達蛋白的技術，是利用21－23bp小干擾RNA片段誘導序列互補mRNA降解，導致目的基因轉錄后活性下調，從而調控生物體內功能基因表達［9］。siRNA也可通過抑制DNA損傷修復酶（如DNA－PKcs、ATM、ATR等）而增強腫瘤細胞對化療、放療的敏感性，增強殺瘤活性［10］。目前該技術已廣泛應用于基因治療研究，且開始進入腫瘤治療領域，利用siRNA技術封閉癌基因成為高特異性治療腫瘤的新希望［11，12］。

本實驗中，我們為了進一步研究chk－1功能，在前期實驗中利用RNAi技術，針對小鼠chk－1基因序列已經成功設計并構建了4個RNAi質粒，酶切及測序鑒定正確后，分別轉染Lewis肺癌細胞，篩選出轉染效果最好的重組質粒；在后期實驗中，我們設計了6個實驗組，即空白對照組、錯義序列組、siRNA組、2Gy照射組＋錯義序列組、2Gy照射組、2Gy照射組＋siRNA組來研究PARP－1放療抑瘤作用。siRNA是在mRNA水平抑制基因表達，mRNA表達減少，并不一定就意味蛋白質表達降低，各種分子的生物功能的執行者是蛋白質，只有蛋白質的表達受到抑制，才能影響該基因的生物功能。因此，實驗中必須確定chk－1mRNA表達是否受到抑制。檢測蛋白表達最常用的經熒光觀察及抗性篩選后決定轉染成功后，進行了蛋白質免疫印跡半定量檢測，通過流式細胞儀檢測細胞細胞凋亡，MTT檢測細胞數，并計算抑制率。免疫組化、Western Blot及RT－PCR檢測chk1阻斷前后表達量變化，結果顯示2Gy照射組＋ pGPU6／GFP／Neo－chk1－536組對Lewis肺癌細胞的抑制率是63．3%，是各組中最高的，差異有顯著性（P＜0．05）。chk阻斷后在細胞中表達量明顯降低。pGPU6／GFP／Neochk－536轉染、2Gy照射可誘導Lewis肺癌細胞凋亡，與正常對照組比，差異顯著（P＜0．05），并且pGPU6／GFP／Neo－chk1－536轉染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細胞凋亡（P＜0．05）。表明RNAi沉默chk1基因的表達，針對chk1的RNAi可以提高Lewis肺癌細胞的抑制率和凋亡。

總之，對chk－1的研究在一定程度上推動了DNA修復機制的研究，有助于我們進一步探索腫瘤的發生機制和治療策略。將來惡性腫瘤治療策略是對腫瘤細胞的特異性殺傷，而對正常細胞DNA影響很小的基因靶向治療。隨著RNA干擾技術的進一步完善，針對chk－1的靶向輻射增敏將會在腫瘤治療中發揮重要作用。

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