不同劑量X線輻射對骨肉瘤HOS細胞中端粒酶的影響

張海玉，單玉興，高 輝，丁福鵬，王 井＊

（1．吉林大學白求恩醫學部第一醫院 小兒外科，吉林 長春130021；2．吉林大學白求恩醫學部第一醫院二部 骨科，吉林 長春130021）

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常見的惡性骨腫瘤。據WHO統計，發病率很高，占原發惡性骨腫瘤的22．36%。典型骨肉瘤一般見于10－20歲年齡段，但在任何年齡段都可發生，包括嬰幼兒，兒童以及老年人。男性發病率較高，男女之比約2∶1。具有很強的局部浸潤能力和肺轉移能力。雖然手術和化療的應用使骨肉瘤的預后有很大的提高，但是很多患者因耐藥而預后不好。端粒酶在腫瘤細胞的發生，發展中所起的作用已被人們廣泛的認可。大量的研究表明，90%以上的腫瘤細胞都具有較高的端粒酶活性，而多數的體細胞則缺少端粒酶活性。這便給了人們攻克腫瘤的希望，放射生物學研究表明，電離輻射作用后可改變細胞周期的進程［1，2］，但是射線照射后骨肉瘤細胞中的端粒酶活性報道甚少。本實驗通過研究不同劑量的X射線輻射對骨肉瘤細胞中端粒酶活性的影響，為放射治療骨肉瘤的臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1．1 細胞培養

人骨肉瘤HOS細胞系，購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。培養基為含10%滅活小牛血清的高糖含酚紅DMEM（GIBCO公司），內含100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素。將每孔以1×104個細胞接種于96孔培養板中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養3d，以備照射。

1．2 X射線

X射線能量為6MeV／u，靶皮距100cm，劑量率2Gy／min，設定細胞吸收劑量為0Gy（對照細胞）、1、2、4和8Gy。每個劑量點設3個平行樣，全部過程在室溫下進行。細胞照射后，立即更換培養液，繼續培養72h。

1．3 輻射敏感性測定

采用MTT法檢測細胞存活。繼續培養72h后每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μl，培養箱內繼續培養4h，終止培養，棄去孔內培養液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇570nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。細胞存活分數（survival fraction，SF）計算公式為：sF（%）＝（實驗組OD值／對照組OD值）×100%。最后以3個平行樣品的sF均值±標準差（ˉx±s）繪制劑量－存活曲線。

1．4 指標檢測

1．4．1 端粒酶活性測定 用酶聯免疫法檢測端粒酶活性。Elisa試劑盒來源于北京鼎國昌盛生物技術有限公司。將被檢樣品以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400建立濃度梯度，將稀釋好的樣品加入酶標反應孔中，每樣品加3孔，每孔100μl，依據Elisa試劑盒使用說明進行操作，檢測端粒酶活性。

1．4．2 端粒酶逆轉率酶（hTERT）測定 應用免疫組化法檢測hTERT的表達情況。SP試劑盒來源于北京鼎國昌盛生物技術有限公司。用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定細胞爬片10－20min，干燥后PBS沖洗3次。然后具體操作依照試劑盒說明。應用image pro plus軟件對免疫組化圖像進行半定量分析。

1．4．3 端粒酶RNA測定 RT－PCR檢測端粒酶基因的表達：按Trizol Reagent RNA提取試劑提取總RNA。測定端粒酶RNA的兩條引物序列分別為：5′－ACCACCAGCGTGTCTGGAGCAAGCCCA AC－3′和 5′－GGGCAACGAAGCGGAGTCGCTGGCACTG－3′，RT－PCR的 產 物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳。葡萄糖－3－磷酸脫氫酶作為內對照。

2 統計學分析

統計學處理：采用SPSS進行統計學處理。數據以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。

3 結果

3．1 X線照射后細胞存活

細胞存活曲線描述了輻射吸收劑量與細胞存活分數之間的關系。用MTT法測定，設3個平行樣，細胞存活曲線按對數標度繪制。（見圖1）。骨肉瘤HOS細胞的存活明顯降低，而且未見明顯的后期細胞增殖。相關性分析結果顯示，細胞的存活率與輻照劑量呈負相關（P＜0．01）。

圖1 不同劑量X線照射后72h細胞存活曲線

3．2 X線照射后端粒酶活性

細胞受照后72h進行端粒酶提取和 酶聯免疫法端粒酶活性檢測（見圖2）。由圖可知其端粒酶活性隨輻照劑量增加而增高。其中，輻射劑量在1 Gy、2Gy處，其端粒酶活性較對照組升高相對較小；輻射劑量在4Gy處，端粒酶活性最強，實驗組明顯高于對照組，且增長勢頭強勁；而輻射劑量在8Gy處，端粒酶活性仍高于對照組，但是增長勢頭明顯回落，可能與細胞存活率明顯下降有關，可能與細胞增殖受到明顯抑制有關。

圖2 不同劑量X線照射后72h細胞內端粒酶活性比較

3．3 X線照射后hTERT檢測

應用Image P ro Plus 5．0軟件對免疫組化圖像分析表明各圖像灰度值逐漸降低，亦說明各圖像蛋白含量逐漸增高。表格數據顯示實驗組的hTERT表達明顯強于對照組，且表達強度明顯與劑量呈正相關（見表1）。

表1 免疫組化圖像灰度值分析

3．4 X線照射后端粒酶RNA的表達

抽取對照組和實驗組的端粒酶RNA，應用RTPCR技術。（見圖3）照射后，骨肉瘤HOS細胞內端粒酶RNA高表達，在4Gy時，電泳條帶亮度最高，說明樣品含量最大。總體來看，很明顯樣品含量與劑量呈正相關。

圖3 不同劑量X線照射后72h端粒酶RNA水平

4 討論

放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，尤以X線最為普遍應用。經放射治療后，正常細胞和惡性腫瘤細胞獲得同樣的殺傷效果，但是由于惡性腫瘤細胞的營養供應不足和增殖機制不完善，與正常組織相比，它的組織修復能力相對較差。這是放射治療的基本原理。

端粒酶是腫瘤細胞無限增殖的基礎，除了少數的造血干細胞，生殖細胞，T細胞，B細胞及皮膚基底層細胞等增殖細胞外，正常細胞內無端粒酶。hTERT是端粒酶的蛋白質亞單位，與端粒酶的活性高低密切相關，是端粒酶延長端粒的關鍵酶。人類的端粒酶有3個亞基，包括人端粒酶RNA、端粒酶相關蛋白和端粒酶逆轉錄酶（hTERT），前兩種成分在端粒酶陰性的正常組織中廣泛表達，而hTERT僅在端粒酶陽性的腫瘤細胞中表達。腫瘤細胞內沒有hTERT，端粒酶無法維持端粒的長度。眾多研究表明，端粒酶活性降低的關鍵是hTERT活性的下調；端粒酶激活的主要途徑也是hTERT的表達的增強。

細胞內的DNA是放射線的靶點。X線進入人體后，產生的次級電子可直接擊中細胞內的DNA雙鏈，使其產生單鏈或雙鏈斷裂。水分子受到射線作用后發生電離而產生自由基，自由基和有毒成分對DNA分子產生破壞作用，達到殺死細胞的作用。

本實驗表明，隨著X線劑量的增加，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA的表達均增高且大致同步。其中，在1Gy、2Gy處，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表達較對照組升高相對較小，但細胞存活率較高，這可能是射線量低，沒能達到致死腫瘤細胞的程度；當輻射劑量達4Gy、8Gy時，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表達較對照組升高非常明顯，細胞存活率急劇下降，可能是射線量達到了致死腫瘤細胞的程度，腫瘤細胞需要調動所有機制阻止細胞進入凋亡程序，hTERT和端粒酶RNA表達增強，端粒酶異常活躍。也可能是射線損傷了端粒，使端粒酶活性增強，但端粒酶活性的增強最終也沒能夠阻止骨肉瘤細胞進入凋亡程序。雖然在8Gy時，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA含量比4Gy時的增長勢頭有所降低，但仍強于對照組。說明在8Gy是，單個細胞內的端粒酶，hTERT和端粒酶RNA含量的比例較其他樣品均高。這些數據表明，在x射線的干擾下：X射線劑量與骨肉瘤細胞存活率呈負相關；X射線劑量與端粒酶活性呈正相關；骨肉瘤細胞存活率與端粒酶活性呈負相關；hTERT，端粒酶RNA和端粒酶活性三者屬同步關系。

5 結論

也有實驗表明端粒酶活性水平并不與照射后細胞的存活水平平行，但是端粒酶活性變化與輻照所用的射線及輻照劑量有關已成共識。中小劑量照射后細胞死亡數隨著照射劑量的增加而增加，而修復反應明顯，常表現出酶活性的增高。以上實驗數據能否真實地反映放療對骨肉瘤細胞的殺傷性，是否能夠確定放療對骨肉瘤細胞的療效，還不能確定；端粒酶是否參與放射誘發的損傷修復及端粒酶活性檢測，能否用于放療效果評估有待深入研究；端粒酶與放射治療的關系還有待進一步探討。

［1］Teyssier F，Bay JO，Dionet C，et al．Cell cycle regulation after exposure to Ionizing radiation［J］．J Bull Cancer，1999，86：345．

［2］Hwang A，Muschel RJ．Radiation and the phase of the cell cycle［J］．J Radiat Res，1998，150：52．