骨髓胚胎樣干細胞的形態結構特征觀察

龐榮清，張永云，2＊，鄧永麗，馬麗花，何 潔，趙 晶，潘興華，張 成

（1．成都軍區昆明總醫院 干細胞與組織器官工程研究中心，云南 昆明650032；2．云南農業大學基礎實驗研究中心，云南 昆明650201；3．中山大學附屬第一醫院 神經內科，廣東 廣州510080）

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的不成熟細胞。自從Friedenstein首次從骨髓組織中分離到間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）以來［1］，科學家們發現MSCs具有自我更新和多向分化的潛能［2，3］，在再生醫學研究方面具有重要價值，但采用Friedenstein建立的經典方法獲得的MSC其實是一群異質細胞［4］。

最近的研究證實，采用不同的培養方法可以從骨髓中分離到表達胚胎干細胞抗原標志的干細胞，并分別被命名為多潛能成體祖細胞（multipotential adult progenitor cell，MAPC）［5］、骨髓來源成體多潛能誘導細胞（marrow－isolated adult multilineage inducile cell，MIAMI cell）［6］、很小的胚胎樣干細胞（very small embryonic－like stem cell，VSEL）［7］等，為探索改進骨髓干細胞的分離擴增方法進行了有益的探索。為了方便描述這些表達胚胎干細胞抗原標志的細胞，參照Kucia的命名方法［7］，在本文中將表達胚胎干細胞抗原標志的這些細胞命名為胚胎樣干細胞 （Embryonic－like stem cells，ELSCs）。其中，Battula報道了分離ELSCs的簡便方法［8］，于是我們嘗試分離了ELSCs，并觀察了其形態結構特征。

1 材料和方法

1．1 材料

DMEM／F12購自 HyClone公司。明膠、2－mercaptoethanol購自Sigma公司。Knockout－DMEM、serum replacement（SR）、glutamine、non－essential amino acids（NEAA）和新生牛血清（Newborn cattle serum，NCS）均購自invitrogen公司。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自Cell Systems公司。

1．2 ELSCs和MSCs的分離培養

骨髓來自于一名8歲非造血系統疾病男孩，參照Battula報道的方法［8］，用無血清培養基重懸單個核細胞并轉移到事先用明膠包被過的培養瓶中靜置培養以分離擴增ELSC。無血清培養基是添加了20%SR、2mM L－glutamine、1%NEAA、0．1mM 2－mercaptoethanol 和 5ng／ml bFGF 的 knockout－DMEM培養液。培養瓶的包被：每個培養瓶中加入5ml 0．1%的明膠溶液室溫條件下靜置30min，然后吸棄明膠溶液于室溫條件下風干即可。作為對照，用含血清培養基重懸單個核細胞并轉移到未包被的培養瓶中靜置培養以分離擴增MSC。含血清培養基為含10%NCS的DMEM／F12培養液。光學顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照。每4天換液，到細胞生長至80%融合狀態時，用trypsin／EDTA消化傳代細胞。

1．3 超微結構觀察

消化收集生長良好的ELSCs和MSCs，離心使其變為細胞團塊，加入預冷的2．5%戊二醛溶液于4℃條件下前固定24h，吸棄戊二醛，將細胞團塊挑出，包入擦鏡紙內，裝入小瓶中，加入PBS重復漂洗3次（每隔15min 1次）。再加入1%鋨酸溶液于室溫條件下后固定1h。吸棄鋨酸，加入PBS漂洗，步驟同上。乙醇逐級脫水，丙酮浸透后，再用環氧樹脂包埋，修塊，切片后，用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾復染，在透射電鏡下觀察細胞超微結構并拍照。

1．4 細胞核型分析

消化收集第十代ELSCs和MSCs，按本實驗室建立的染色體制備方法［9］進行核型分析，即1ml細胞沉淀液加入0．25μg／ml的秋水仙堿于37℃孵育120min，繼而用0．075mol／L的低滲KCl溶液裂解細胞，再用甲醇：冰醋酸固定，低速離心后棄上清，將細胞沉淀滴片，RHG顯帶處理，Gimesa染色，光學顯微鏡下分析拍照。

2 結果

2．1 ELSCs的形態特征

分別采用胚胎干細胞的擴增方法和傳統的MSCs分離方法可以從同一份骨髓中分離到ELSCs和MSCs，但在光學顯微鏡下可見這兩種細胞形態存在明顯差別。原代ELSCs體積較小、形態纖細均一（見圖1A），傳代后細胞貼壁很快，在瓶中均勻分布生長（見圖1B），更容易擴增，而且傳代10代后細胞仍然保持細長形態，只是變得更長，增殖活性依然較好（見圖C）。而原代MSCs體積較大，常包括紡錘形、多邊性和圓形等多種細胞形態（見圖1D），傳代后后兩種形態細胞迅速消失，細胞形態變得均一但比較扁平，傳代時細胞貼壁速度明顯慢于ELSCs，而且細胞常呈叢狀分布（見圖1E），長至密集狀態時呈現典型的旋渦狀，傳代10代后的細胞增殖活性明顯降低，細胞形態非常扁平，折光性不強，呈現明顯的細胞老化現象（見圖1F）。

2．2 ELSCs的超微結構觀察

分別消化收集生長良好的第四代細胞，制成超薄切片，在透射電鏡下觀察兩種細胞的超微結構，可見ELSCs的一個突出特點是絕大部分細胞膜表面有十分顯著的偽足（見圖2A），呈花朵狀形態（見圖2B，B1），少數細胞的細胞膜僅形成少量微絨毛樣突起（見圖2A）；細胞胞漿內空泡較少或沒有，有豐富的粗面內質網，但不擴張（見圖2B，B2）。與之不同的是有的MSCs細胞膜光滑無突起（見圖2C），有的細胞膜表面有微絨毛樣突起（見圖2F，F1），多數細胞胞漿內有大小不一的空泡（見圖2D），有豐富的粗面內質網而且明顯擴張形成內質網池，池內顯示中等程度的電子密度（見圖2E，F，E1，F1）。

2．3 ELSCs的核型分析

一直采用無血清培養基在明膠包被過的培養瓶中培養、trypsin／EDTA 消化連續傳代10代的ELSCs，制備其染色體，觀察結果顯示：連續傳代10代的ELSCs核型仍然是正常的（見圖3）。

3 討論

圖1 在光學顯微鏡下ELSCs和MSCs的細胞形態特征

眾所周知：無血清培養基（含20%SR、2mM L－glutamine、1%NEAA、0．1mM 2－mercaptoethanol和5ng／ml bFGF的knockout－DMEM 培養液）一直是用來擴增胚胎干細胞的專用培養基，牛血清的加入將導致胚胎干細胞的分化。運用胚胎干細胞的擴增方法來擴增骨髓干細胞是個很有創意的嘗試，它至少可以引導我們去進一步思考究竟什么樣的細胞才是真正意義上的MSCs。采用Battula報道的方法［8］，我們從骨髓中分離到 ELSCs，這些 ELSCs不同于來自相同骨髓的MSCs，體積較小、形態纖細均一，細胞貼壁和生長速度快，與先前的報道結果一致［8］。導致ELSCs形態差別的重要因素至少包括促有絲分裂原bFGF的加入和明膠的存在，前者已被證明具有維持干細胞“干性”和促進增殖的作用［10，11］，后者的主要成分膠原具有促進細胞貼壁和增殖的作用［8］，綜合作用的結果導致了ELSCs不成熟的表型。

圖2 透射電鏡下ELSCs和MSCs的細胞超微結構圖

圖3 連續傳代10代的ELSCs染色體圖

在此基礎上我們又觀察并比較了ELSCs和MSCs的超微結構，結果首次發現二者之間存在顯著差別：第四代ELSCs的一個突出特點是絕大部分細胞膜表面有十分顯著的花朵狀的偽足，只有少數細胞的細胞膜有少量微絨毛樣突起，提示ELSCs形態比較一致，即純度較高。細胞膜上大量偽足的出現可能表明該細胞膜上有某些MSCs細胞膜不具有的結構，這很可能與Battula報道的一些多潛能抗原標志的表達有關［8］。ELSCs的另一個顯著特點是胞漿內有豐富的粗面內質網，但不擴張，表明ELSCs處于代謝靜息狀態。我們知道：粗面內質網是由核糖體和內質網構成的基本細胞器，是合成分泌性蛋白、多種膜蛋白和酶蛋白的重要場所，普遍存在于分泌蛋白質的細胞中，越是分泌旺盛的細胞其數量越多，如漿細胞，而未分化細胞和腫瘤細胞中較少。與ELSCs明顯不同的是部分MSCs細胞膜光滑無突起，部分細胞膜表面有微絨毛樣突起，多數細胞胞漿內有大小不一的空泡，有豐富的粗面內質網而且明顯擴張形成內質網池，池內顯示中等程度的電子密度，表明MSCs形態不一致，即細胞純度不高，更重要的是表明MSCs處于細胞活動期，因為擴張的粗面內質網內有中等程度的電子密度，提示細胞正在分泌生長或分化所需的物質，即細胞處于一定程度的分化狀態。這些結果證明ELSCs處于比MSCs相對更原始的狀態。鑒于ELSCs和MSCs在超微結構方面存在的顯著差別，我們認為電鏡技術可以成為干細胞鑒定的有效手段，因為即便表型相同（均表達CD44、CD90、CD105）的 MSCs，由于來源不同其超微結構也明顯不同［12］，可見電鏡技術作為干細胞鑒別手段其靈敏更高。

已知間充質干細胞連續傳代不會導致其核型變異，為此我們觀察了ELSCs傳代的安全性，結果證實：采用無血清培養基在明膠包被過的培養瓶中培養、trypsin／EDTA消化傳代10代不會導致ELSCs的核型發生變異，表明ELSCs的擴增培養方法也是安全可靠的。

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