PCNA在膽管癌中的表達及意義

張桂東 宋春麗 周少英 武來興 尹清臣

近些年來膽管癌的發病率逐漸升高，雖然醫學影像學和臨床其他檢測方法的有所提高，但是由于膽道系統的解剖和生理學特點，早期診斷和早期治療均較困難，導致許多患者就診時已是晚期，失去了手術機會，且膽管癌的惡性程度較高、預后差，給普通外科醫生提出了嚴峻的挑戰。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助因子，在DNA復制、細胞增殖及細胞周期調控中發揮重要作用。但是有關PCNA在膽管癌中的研究甚少。本實驗應用免疫組化法，RT-PCR方法來檢測PCNA在膽管癌組織中的表達，探討它們與膽管癌臨床病理因素之間的關系。旨在為判斷膽管癌的惡性程度和生物學行為提供客觀指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例原發性膽管癌、17例相同個體癌旁膽管組織及20例正常膽管組織來自邯鄲市中心醫院2005年12月至2010年12月手術切除標本。所有膽管癌患者術前未經任何治療。所有標本為術中立刻獲取的新鮮膽管癌組織、相同個體癌旁(距瘤緣0.5 cm)膽管組織及正常膽管組織，保存于液氮中，用于RT-PCR實驗。術后膽管癌標本立刻固定在10%中性甲醛溶液，包埋在石蠟里，用于免疫組化研究。為避免誤差，由兩位有經驗病理醫師進行病理組織學診斷。42例膽管癌患者中男23例，女19例;年齡40～76歲，平均年齡60歲;高和中分化膽管癌27例，低分化膽管癌15例;肝門部25例，中下段17例;其中有14例發生了淋巴轉移。

1.2 主要試劑 鼠抗人PCNA單克隆抗體(北京中杉公司);FITC標記的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch Laboratiries Inclot58630);Trizol試劑(美國 Gibco BRL公司);RT試劑盒(美國Promega公司);PCR酶混合物(賽百盛生物工程公司);dNTP(賽百盛生物工程公司);GAPDH引物(上海生工生物工程公司);PCNA引物(上海生工生物工程公司);100 bp DNA marker(賽百盛生物工程公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 采用免疫組化SP法，對標本中的PCNA蛋白進行檢測，按試劑盒說明嚴格進行操作;結果判定免疫組化根據染色反應的深度及陽性細胞的數量分別記分為0～3分，其中染色深度以多數細胞的呈色反應為準。不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞數＜10%為0分，10% ～45%為1分，46% ～70%為2分，＞70%為3分，并根據這兩項指標的積分數分為陰性結果和陽性結果，即陰性(－)為0～1分，陽性(+)為2～9分。

1.3.2 采用RT-PCR法，對標本中的PCNA mRNA進行檢測，亦按試劑盒說明嚴格進行操作。

1.4 統計學分析應用SAS 6.12統計軟件，計量資料以±s表示，不同組別實驗數據比較采用方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用t檢驗(LSD法)，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測結果 膽管癌組織、正常膽管組織中PCNA表達的陽性率分別為71.19%(30/42)和25.00%(5/20)，差異有統計學意義(χ2=17.205，P=0.001)。膽管癌組織的陽性率亦明顯高于正常組織;膽管癌組織中PCNA蛋白的表達與年齡、性別、腫瘤所處位置，組織學分化及其淋巴轉移的比較見表1。

表1 PCNA蛋白在膽管癌組織中的表達與臨床參數的關系(免疫組化) 例(%)

2.2 RT-PCR檢測結果 膽管癌組織的PCNA mRNA表達高于正常組織有統計學意義(F=10.84，P=0.0001)。見表2。

表2 PCNA mRNA在膽管癌組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(RT-PCR)±s

表2 PCNA mRNA在膽管癌組織、癌旁組織及正常膽管組織中的表達(RT-PCR)±s

注:與膽管癌組比較，*P ＜0.05

組別PCNA OD值正常膽管組(n=20) 0.5605 ±0.0331*膽管癌旁組(n=17) 0.5692 ±0.0408*膽管癌組(n=42)0.6303 ±0.0773

2.3 膽管癌組織中PCNA mRNA的表達與臨床參數的關系見表3。

3 討論

膽管癌系指發生在膽道系統的惡性腫瘤。膽管癌患者早期一般無明顯臨床表現，目前尚未發現膽道惡性腫瘤的特異性的標志物，因而膽道系統惡性腫瘤的診斷仍主要靠傳統的影像學技術，如B型超聲，內鏡逆行性膽胰管造影(ERCP)、CT、磁共振膽胰管成像(MRCP)核素顯影掃描和血管造影等。同時膽管癌的治療仍以手術切除為主，放療和化療的療效尚需進一步探索。而基因診斷和基因治療可能成為今后的發展方向或成為攻克膽管癌的最終途徑。

表3 PCNA mRNA在膽管癌組織中的表達與臨床參數的關系(RT-PCR)±s

表3 PCNA mRNA在膽管癌組織中的表達與臨床參數的關系(RT-PCR)±s

臨床參數 PCNA OD值 P值性別男(n=23) 0.6509 ±0.0592女(n=19) 0.6240 ±0.0458 0.108年齡(歲)≤60(n=24) 0.6507 ±0.0467＞60(n=18) 0.6389 ±0.0464 0.436腫瘤位置肝門部(n=25) 0.6382 ±0.0417中下段膽管(n=17) 0.6501 ±0.0527 0.419組織學分級中 ～高分化(n=27) 0.6212 ±0.0224低分化(n=15) 0.6361 ±0.0161 0.029淋巴轉移情況未轉移(n=28) 0.6202 ±0.0555已轉移(n=14)0.6323 ±0.0390 0.470

膽管癌的病因和發病機理同其他器官的惡性腫瘤一樣目前仍尚未完全明了。多數學者認為其可能與結石形成、膽汁淤積及膽道感染有關［1］。目前遺傳學的研究已經發現，與其他惡性腫瘤一樣，膽管癌的發生發展與染色體癌基因及抑癌基因的改變有關，認為k-ras、c-myc、c-met等的過度表達及其抑癌基因p53、p16、DPC4等的突變缺失與膽管癌的發生發展密切相關，但各種癌基因和抑癌基因在膽管癌的發生發展過程中的相互作用及其協調關系尚不清楚［2］。因此進一步從分子生物學的角度研究膽管癌的發病機制，可望為膽管癌的基因診斷和治療提供理論依據。

PCNA基因位于20號染色體上，含6個外顯子，5個內含子，長約710 kb，編碼36 KD的PCNA蛋白。PCNA蛋白亦為一種細胞周期蛋白，是一種細胞增殖標志物，是DNA多聚酶δ的輔酶，它協調DNA前導鏈和隨從鏈的合成，是DNA復制過程所必需［3］，其在細胞內的含量具有周期性，在靜止期細胞內含量很少，G1晚期開始增加，S期達高峰，G2期、M期明顯下降［4］，正常情況下，p21蛋白與 PCNA結合形成復合物，抑制PCNA的功能，在多種基因或細胞因子的調控下，PCNA含量超過p21蛋白的結合能力時，即可與相應的DNA復制位點結合，輔助DNA聚合酶δ進行DNA復制，從而使細胞進入S期［5］。PCNA是一種酸性、無組蛋白的細胞核多肽，其陽性細胞多分布于癌巢周邊和浸潤前緣，在癌巢中央尤其是明顯角化的細胞中表達極低。近些年來，國際上對PCNA的的研究一直比較熱［6，7］，國內張元等［8］的研究結果，表明 PCNA 能較好地反映胰腺癌的惡性程度和增殖活性，提示它可作為反映胰腺癌預后的一個可靠參數，羅慶元等［9］的研究結果，亦表明PCNA能較好地反映食管癌的增殖活性，提示它也可作為反映食管癌預后的一個較好參數。

本實驗從蛋白和基因兩個水平上來研究PCNA在不同膽管病變中的表達，從而探討PCNA表達異常與膽管癌發生和發展之間的關系。本實驗中利用免疫組化方法和RT-PCR法檢測了42例膽管癌組織和20例正常膽管組織中PCNA的表達情況。42例膽管癌患者中男23例，女19例;年齡40～76歲，平均年齡60歲;高和中分化膽管癌27例，低分化膽管癌15例;肝門及肝內膽管癌25例，中下段17例。其中有14例發生了淋巴轉移。從試驗結果可以得出，蛋白和基因兩個水平上的PCNA在不同膽管病變中的表達具有一致性，即在膽管癌中的表達明顯高于正常的膽管組織差異有統計學意義(P＜0.05)。進一步研究表明，PCNA的表達隨著腫瘤的惡性程度的升高(即腫瘤的病理學分化程度的降低)而升高，更進一步說明了PCNA是一個有價值的腫瘤標志。

1 黃潔夫主編.肝臟膽道腫瘤外科學.第1版.北京:人民衛生出版社，1999.710-711.

2 鄒聲泉，龔建平主編.外科學——前沿與爭論.第1版.北京:人民衛生出版社，2003.604-605.

3 Waga S.The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA.Nature，1994，369:574-578.

4 Zhu SC，Li R.Impact of simultaneous assay.the PCNA，cyclinD1，and DNA content with specimens before and after preoperative radiotherapy on prognosis of esophageal cancer-possible incorporation into clinical TNM stag system.World JGastroenterol，2005，11:3823.

5 Moldovan GL，Pfander B，Jentsch S.PCNA，themaestro of the replication fork.Cell，2007，129:665-679.

6 Fan J，OtterleiM，Wong HK，etal.XRCC1 co-localizes and physically interacts with PCNA.Nucleic Acids Res，2004，32:2193-2201.

7 Bravo R，Frank R，Blundel P，et al.Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNA polymerase-delta.Nature，1987，326:515-517.

8 張元，錢家勤.胰腺癌組織中增殖細胞核抗原的表達及臨床意義.肝膽外科雜志，2000，8:434-436.

9 羅慶元，蔣瑩.食管鱗癌組織中c-fos和PCNA的表達及臨床病理意義.新疆醫科大學學報，2010，33:30-35.