新型腫瘤標志物用于原發性肝癌診斷的臨床研究

張宏 葉迎賓 李淑敏 張志濤 李強 賀建軍 李軍 賈愛紅

原發性肝癌(PHC)是全球惡性腫瘤死亡的第三大原因，每年約有60萬人死于肝癌。在我國癌癥患者中，其中56%的為肝癌，已成為第二惡性腫瘤。普遍認為肝癌的發生是一個包括癌基因激活和抑癌基因失活的多因素、多步驟過程［1］。但關于肝癌的確切病因尚不清楚。在我國主要以病毒性肝炎(HBV、HCV)的慢性持續感染是肝癌發生的主要背景，乙型肝炎相關者占70% ～80%，丙型與丁型肝炎相關者為15% ～20%。約5%的肝癌可能與黃曲霉毒素、飲用水污染、遺傳因素等有關［2］。往往當發現肝癌時，已錯過最佳的治療時間，因此當務之急就是要找到一種對肝癌細胞靈敏度和特異性高的標志物(如AFP-L3、GPC3、AFU)。本文通過對肝癌患者的 AFP-L3、GPC3、AFU的檢測數據的分析，探討三者聯合檢測來診療肝癌的效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年5月至2011年1月在我院肝病科住院且經病理學(瘤體直徑＞2 cm)證實的肝癌患者100例(PHC組)，男62例，女38例;年齡30～72歲，平均年齡53.2歲。肝硬化患者50例(肝硬化組)，男37例，女13例;年齡31～65歲，平均年齡48.7歲。肝癌和肝硬化患者均符合2000年中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會聯合修訂的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎診斷標準。正常對照者50例為對照組，男25例，女25例;年齡20～30歲，平均年齡24.5歲。3組一般資料具有均衡性。

1.2 儀器與試劑 儀器為Thermo公司的 MK3酶標儀(簡稱“酶標儀”);AFP-L3、GPC3、AFU試劑盒均由上海雅吉生物科技有限公司提供。檢測AFP的儀器為西安核儀器廠提供的XH—6080十探頭全自動智能γ免疫計數器，其試劑盒有北京北方生物技術研究所提供，嚴格按照說明書操作。

1.3 標本采集 取被檢者空腹靜脈血5 ml，分離血清，置－20℃冰箱保存備用。

1.4 方法 AFP-L3、GPC3、AFU三者檢測均采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書操作。用酶標儀檢測其OD值，根據標準濃度曲線圖，分別計算出其濃度。AFP檢測采用放射免疫法，AFP＞20μg/L，AFP-L3＞10%視為陽性;GPC3檢測值 ＞3.0μg/L視為陽性;AFU檢測值＞40μg/L視為陽性。

1.5 統計學分析 應用SPSS 11.0統計軟件，3組陽性率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組AFP-L3陽性率比較 PHC組的陽性率明顯高于肝硬化組和正常對照組(P＜0.01);肝硬化組的陽性率與對照組差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 3組AFP-L3陽性率比較

2.2 3組GPC3陽性率比較 PHC組的陽性率明顯高于肝硬化組和正常對照組(P＜0.01);肝硬化組的陽性率與對照組差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 3組GPC3陽性率比較

2.3 3組AFU陽性率比較 PHC組的陽性率明顯高于肝硬化組和對照組(P＜0.01);肝硬化組的陽性率與正常對照組的差異有統計學意義(P＜0.01)。見表3。

表3 3組AFU陽性率比較

2.4 單項或AFP-L3與 GPC3和AFU聯合檢測3組的結果比較 聯合檢測中有一項為陽性即為聯合檢測陽性。三者聯合檢測時，PCH的敏感度為96.0%(192/200)，特異度為76.0%(76/100)，準確度為89.3%(268/300)，高于任何單項和聯合檢測的敏感度和準確度。見表4、5。

3 討論

目前，診斷原發性肝癌的主要血清標志物是AFP，其在各種肝病中均有不同程度的升高［3］，是由于肝細胞再生的過程產生一定量的 AFP［4］。由于 AFP 敏感度和特異性不高［5］，不能滿足臨床的需要。

1970年，通過對原發性肝癌患者血清的淀粉凝膠電泳試驗，發現AFP電泳移動度不同源于唾液酸含量的不同，因此提出AFP異質體這一概念［6］。1981年有學者報道了LCA結合型AFP在肝癌診斷中的價值，并很快得到了臨床資料的驗證［7］。Sato等［8］報道，AFP異質體升高的肝硬化患者多數在3～18個月內被診斷為肝癌。Shiraki等［9］對AFP異質體陽性的肝癌患者進行回顧分析后也發現在影像學檢查發現肝癌特征性占位性病變前12個月就有41%的患者AFP異質體升高。甲胎蛋白異質體AFP-L3現已列入1999年第四屆全國肝癌學術會議上通過的原發性肝癌臨床診斷標準的肝癌標記物之一，也已經列入2007年6月衛生部頒布的臨床檢驗項目列表中，臨床意義清晰，但是長期以來缺乏能夠應用于臨床常規使用的方法而無法推廣。美國食品藥品監督管理局(FDA)2005年批準檢測AFP-L3指標用于肝癌預警，并把AFP-L3診斷肝癌的陽性臨界值定為10%［10］。2007年6 月，王永忠等［11］報道，AFP-L3 是肝癌鑒別診斷的有用指標，其靈敏度為72.3%，特異性為97.2%。2010年9月，丁賢等［4］報道，表明AFP-L3用于肝癌的診斷不受AFP≥400μg/L作為肝癌診斷標準的限制，當AFP-L3% ＞10%而AFP輕度升高提示發生肝癌的可能性較大。從表1和表5中聯合分析，由于本文收集的肝癌標本其瘤體直徑大于2 cm，所以ALP-L3的敏感度、特異度和準確度高于國內其他文獻。PHC和肝硬化的鑒別，ALP-L3運用具有明顯的優勢。

表4 3組聯合檢測模式患者分布 例

表4 AFP-L3/GPC3/AFU單項或聯合檢測PHC的診斷效能比較%

GPC3是1996年克隆出來的一種新型基因［12］，對生長調控起著重要作用。由于該基因的突變導致了細胞增殖和凋亡失去平衡。Hsu等［13］報道154例肝癌組織中，74.8%檢測到GPC3mRNA，而在正常肝和肝炎組織中只有3.2%檢測到GPC3基因。2010年7月Bruix等［14］共同指出，小病灶的肝活組織病理學檢查不能確認為HCC的組織，應用所有可用標志物之一的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3進行染色，以提高診斷準確性。宋孟锜［15］等指出，GPC3在肝癌組織表達高于癌旁和正常肝組織，GPC3與腫瘤大小、腫瘤數目、HBsAg及AFP水平無明顯相關，而與病理分級和臨床分期有關。因此，提示臨床要慎重對待高于正常肝組織的GPC3的檢測值，要科學合理地進行檢查，防止漏檢，進而提高肝癌的診治率。到目前為止文獻多次報道［16－18］，本文顯示，GPC3作為一項靈敏度和特異性較高的新型指標，為今后診斷早期肝癌走向常規化奠定堅實的基礎。

1980年法國學者 Deugnier等［19］研究發現，AFU在診斷肝細胞癌中敏感性好，陽性率高，是AFP陽性率的三倍以上，對AFP陰性病例及小細胞肝癌的診斷價值極大，是早期原發性肝癌診斷的有用指標。AFU的高低與腫瘤的大小無明顯的關系，可能有利于小肝癌的診斷。2004年，徐偉等［20］在AFU和AFP聯合檢測對原發性肝癌的臨床意義中表明AFU和AFP在診斷PHC時無相關性，但有較大的互補性。聯合檢測AFU和AFP則可顯著提高PHC陽性檢出率。2007年5月，殷建立等［21］提出AFU診斷PHC存在假陽性，與慢性肝病間有重疊現象，AFP和AFU聯合檢測遠高于單項檢測。2008年，許勇臣等［22］提出，雖然AFP是原發性肝癌最特異的腫瘤標志物，但靈敏度不如AFU，二者聯合用于檢測原發性肝癌可相互補充，如果二者檢測結果同時為陰性時，該聯合檢測不能作為排除性診斷的依據。從表5中發現也能證實這一點。

總之，蛋白質組學本身正在迅速發展，同時隨著其在腫瘤標志物研究中的廣泛應用，新的腫瘤標志物不斷被發現。因此要通過試驗組織的合作，綜合分析大量實驗數據，使我們能夠發現具有高敏感度和高特異度的腫瘤標志物用于臨床。

1 陳洪，王智，吳健.肝癌循環腫瘤細胞的研究現狀.臨床肝膽病雜志，2011，27:796-800.

2 韓硬海，李樹桐主編.臨床肝臟病學.第1版.濟南:山東科學技術出版社，2004.471.

3 李永利，馬洪濱，郭靜霞，等.甲胎蛋白異質體L3預警原發性肝癌的研究.中華實驗和臨床病毒學雜志，2008，22:336-338.

4 丁賢，劉樹業，周淑芬，等.甲胎蛋白異質體在鑒別良惡性肝病中的應用價值.天津醫藥，2010，38:821-822.

5 徐萬菊，韓玉剛，張芊，等.甲胎蛋白異質體與高爾基體蛋白73在甲胎蛋白低濃度肝細胞癌診斷中的意義.中華醫學檢驗雜志，2012，35:174-176.

6 CassandraW，Researchers look for“sweet”metho to diagnose cancer.Nature Medicine，2007，13:1267.

7 殷正豐.甲胎蛋白異質體作為腫瘤標志物的臨床應用.實用腫瘤雜志，2004，19:1-4.

8 Sato Y，Nakatak T，Kato Y，et al.Early recognition of hepatocellular carcinoma based on altered profilesofalpha-fetoprotein.N Engl Jmed，1993，328:1802-1806.

9 Shiraki S，Takasek W，Tameda Y，et al.A clinical study of lectin-reactive alpha-fetoprotein as a newly indicator of hepatocellular carcinoma in the follow-up of cirrhotic patients.Hepatology，1995，22:802-807.

10 U.S.Food and Drug Administration.Guidance for Industry and FDA Staff.Class ⅡSpecial Controls Guidance Document:AFP-L3%Immunological Test Systems［EB/OL］.(2005-10-04)http://www.fda.gov

11 王永忠，吳國祥，陳敏，等.甲胎蛋白異質體檢測在肝癌鑒別診斷中的應用.江蘇醫藥，2007，6:565-567.

12 Pilia G，Hughes-Benzie RM，MacKenzie A，et al.Mutations in GPC3，a glypican gene，cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome.Nature Genet，1996，12:241-247.

13 Hsu HC，ChengW，Lai PL.Cloning and expression of a developmentally regulated transcriptMXR7 in hepatocellular carcinoma:biological significance and temporospatial distribution.Cancer Res，1997，57:5179-5184.

14 Bruix J，Sherman M.Management of hepatocellular carcinoma:an update.Hepatology，2011，53:1020-1022.

15 宋孟锜，楊永飛，王冬冬等，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3和甲胎蛋白聯合檢測對原發性肝癌的診斷價值.臨床肝膽病雜志，2011，27:391-393.

16 付順軍，李紹強，林杰，等.血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白測定在肝細胞癌診斷中的價值.中華普通外科學文獻(電子版)，2010，12:553-554.

17 王濤，王鳳梅，高英堂，等.磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在肝穿刺活檢標本中鑒別診斷的意義.世界華人消化雜志，2011，19:693-699.

18 劉斐燁，蘇寧，梁繼珍，等.Glypican-3蛋白在肝癌患者血清中的表達及意義.山東醫藥，2010，50:55-56.

19 Deugnier Y，Letreat A，Glaise D，et al.A study of lysosomal enzyme activities in serum and leakocytesion chronic hepatic disease.Clin Chim Acta，1980，128:385.

20 徐偉，魏麗晶，王美霞.聯合檢測血清α-L-巖藻糖苷酶、甲胎蛋白對原發性肝癌患者的臨床意義.臨床肝膽雜志，2004，2:42-43.

21 殷建立，周秦蜀，段仲璧，等.α-L-巖藻糖苷酶與甲胎蛋白聯合檢測對原發性肝癌診斷的臨床評價.肝膽外科雜志，2007，5:177-178.

22 許勇臣，陶玉濱，楊春生.血清甲胎蛋白、α-L-巖藻糖苷酶聯合檢測對原發性肝癌的診斷價值.實用預防醫學，2009，16:1591-1592.