P27和細胞周期蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達及意義

賀紅艷 張曉麗 趙立斌 賀紅梅

細胞周期受控于細胞周期蛋白(cyclinS)、細胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)和細胞周期依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent kinases inhibition，CDKIs)三種調控因子。當細胞周期啟動、運行和終止異常時，可造成細胞失控性生長，形成腫瘤。P27是CDKI重要成分，對細胞周期具有顯著抑制作用。cyclinE與CDK結合形成復合物，對細胞周期的啟動及各時相的轉換具有關鍵性調控作用，在腫瘤的形成中均發揮了重要作用［1－3］，但在喉鱗狀細胞癌中有關 P27和cyclinE的報道較少，我們研究他們在喉癌中的表達情況，并探討與患者病理特征等因素之間的關系，旨在探討喉癌的發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2004至2008年張家口地區喉鱗狀細胞癌手術切除標本72例，年齡38～70歲，平均年齡52歲。正常喉黏膜21例。

1.2 標本處理 標本經10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片6張，切片厚度5μm。

1.3 試劑及染色 采用S-P免疫組織化學染色方法。鼠抗人P27、cyclinE抗體和S-P試劑盒購自北京中山生物技術有限公司。嚴格按照實驗操作規程進行。每批實驗陽性對照片用已知陽性片作對照;陰性對照片用PBS液代替一抗。

1.4 染色結果判定 每張切片隨機觀察10個高倍視野(×400)，取陽性細胞均值，凡陽性細胞數超過5%定為陽性病例(+)，否則為陰性病例(－)。

1.5 統計學分析 應用SAS 11.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗和Spersman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P27和cyclinE在正常喉黏膜及鱗狀細胞癌中的表達 光鏡下陽性物為棕黃色，P27分布于細胞核，cyclinE多分布于細胞胞核，少數胞漿也同時著色。P27和cyclinE在正常喉黏膜中陽性率分別為61.9%(13/21)和23.8%(5/21);在喉癌中的陽性率分別為30.6%(22/72)和51.4%(37/72)，與正常組比較差異有統計學意義(P ＜0.05)。

2.2 P27和cyclinE的表達與喉癌臨床病理學的關系 P27、cyclinE在喉癌中的表達與分化程度及淋巴結轉移有統計學意義(P ＜0.05)，與發病部位無性(P ＞0.05)。見表1。

表1 P27和cyclinE的表達與喉癌臨床病理學的關系例(%)

2.3 P27和cyclinE相關性比較 P27和cyclinE之間的表達無明顯差異，而且也無相關性(r=0，P ＞0.05)。

3 討論

喉癌是耳鼻喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，發病率較高，占耳鼻喉惡性腫瘤的11.6% ～22%。腫瘤發生的共同特征是細胞周期控制機制的紊亂導致細胞的失控性生長。CDKs和周期素(cyclins)結合，催化細胞周期進程，而CKIs作為細胞周期的負調控因子則抑制其活性或結合。本實驗中檢測cyclinsE是細胞周期素中的一個亞型，對細胞周期有正調節作用;P27則是CDKs家族成員，對細胞周期有負調節作用。

CyclinE是參與細胞周期G1/S轉換的重要調節因子，在正常細胞和腫瘤細胞中主要在G1晚期發揮正常調控細胞周期的作用，其作用機制為:cyclinsE與CDK2結合形成cyclin E-CDK2復合物，促使CDK被磷酸化而具有酶活性，在G1/S轉換過程中發揮作用。P27作為細胞周期的負調控因子，通過兩個途徑抑制細胞周期，即抑制CDK激活和抑制激活后的Cyclin-CDK活性。P27對G1期cyclin-CDK抑制作用最為重要，它能顯著抑制cyclin E-CDK2和cyclin E-CDK4復合物的活性，使細胞周期停滯于G1期和S期的轉換，是G1期限速因子。

大量研究顯示P27與人類腫瘤的發生發展有密切關系，如在大腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、非何杰金淋巴瘤等［3－6］常見腫瘤中均有異常表達。P27蛋白表達的異常與癌癥的發生發展及存活率相關，因此P27可作為癌癥演變的一種重要標志分子［7］。本研究發現喉癌組織中 P27蛋白陽性率(30.6%)明顯低于正常組(61.9%)(P ＜0.05)，說明 P27 表達水平下調可能促進喉癌的發生。P27在頸部淋巴結轉移組中陽性率顯著低于無轉移組，與國內學者曹華等［8］報道一致，表明P27蛋白在喉癌的進展過程中逐漸喪失了作為細胞周期負調控因子的抑制作用，使癌細胞具有更高的惡性程度和侵襲力，另外P27蛋白缺乏，還可導致細胞間粘附力下降，使腫瘤容易轉移。P27在喉癌中的表達與分化程度有關，在高分化組陽性表達率顯著低于低分化組，提示P27蛋白表達水平可能作為反應喉癌惡性程度及預后的重要指標。

研究表明，cyclinE對腫瘤細胞的增殖起重要作用，在某些腫瘤組織及腫瘤細胞中發現cyclinEmRNA和蛋白的表達異常，并與腫瘤的發生、發展密切相關。cyclinsE基因失調，蛋白過量表達見于多種腫瘤如鼻咽癌、胃癌、乳腺癌等［3，9］過度表達，而且與腫瘤的惡性程度及預后有關，已被證明是一種癌基因，具有早期診斷和預后判斷價值，并可作為細胞增殖的又一標志。本研究顯示:cyclinsE在正常組陽性表達率顯著低于喉癌組，表明cyclinsE在喉癌的發生中起重要作用，并對喉癌的早期診斷具有一定價值。在低分化喉癌組及有淋巴結轉移組中cyclinsE均有高表達現象，說明cyclinsE表達過度與分化不良有關，并提示預后不佳。cyclinE的表達與P27的表達無相關性。

目前惡性腫瘤被認為是細胞周期疾病。cyclinsE和P27在喉癌的發生、發展及預后中起著重要作用?，F有學者將外源性P27基因作為目的基因用于腫瘤的基因治療，可明顯抑制腫瘤的生長，促進細胞凋亡及分化成熟［10］。國內陳濟［11］利用RNA干擾技術能特意下調HeLa細胞中cyclinEmRNA含量，抑制宮頸癌細胞惡性增值。P27和cyclinE有可能成為未來腫瘤基因治療的目的基因，采用分子生物學技術，進一步明確其相互作用機制，將為喉癌的基因治療特別是聯合多項基因治療提供廣闊的前景。

1 Kin YT，Zhao M.Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinama.YonseiMed J，2005，46:597-613.

2 Guan XX，Chen LB，Wang JH，et al.Mutations of phosphorylation sites Ser10 and Thr187 of p27Kip1 abolish cytoplasmic reclistribution but do not abrogate G0/1 phase arrest in the HepG2 cell line.Biochem Biophys Res Commu，2006，347:601-607.

3 李作生，李保慶，王國臣.P21和P27基因多態性與女性肺癌的關聯研究.河北醫藥，2010，32:272-275.

4 Sui L，Dong Y，Watanabe Y，et al.Clinical significance of skp2 expression，alone and combined with Jab1 and p27 in epithelial ovarian tumors.Oncol Rep，2006，15:765-771.

5 Kim JY，Lim SJ，Kim HJ，et al.Jun activation domain-binding protein 1 negatively regulate p27 kip1 in non-Hodgkin’s lymphomas.Int JGynecol Pathol，2007，26:242-247.

6 管建云，魏林生，趙高賢，等.PTEN和P27在膀胱移行細胞癌中的表達及其臨床意義.中國現代醫學雜志，2007，17:1118-1120.

7 Nowee Me，Dorsman JC，Piek JM，etal.HER-2/neu and p27Kip1 in progression of Fallopian tube carcinoma:an immunohistochemical and array comparative genomic hybridization study.Histopathology，2007，51:666-673.

8 曹華，張峰.Jabl和p27kipl蛋白在喉鱗狀細胞癌中的表達.中國耳鼻喉頭頸外科，2007，14:523-526.

9 湯聲波，胡國清.細胞周期相關蛋白cyclinE表達與鼻咽癌生物學行為相關性的研究.實用癌癥雜志，2007，22:144-146.

10 Chen J，Willingam T，Shuford M，etal.Tumor suppression and inhibition of aneuploid cell accumulation in human brain tumor cells by etopic overexpression of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIP1.Clin Invest，1996，97:1983-1988.

11 陳濟，潘巍巍，成海恩，等.細胞周期素E的干擾RNA對Hela細胞增殖的抑制作用.第三軍醫大學學報，2007，29:2135-2138.