殼聚糖中藥復方防治非酒精性脂肪性肝炎的實驗研究

王榮琦 李建梅 南月敏 米紅梅 趙素賢 孔令波 任偉光

非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)是非酒精性脂肪性肝病病程進展的中心環節，是單純性脂肪肝發展為肝硬化的必經之路［1］，有效阻止其發生及進展是該病治療的關鍵。殼聚糖是甲殼素脫乙酰基后的產物，具有降血脂、提高免疫力、防癌、防治糖尿病、促進傷口愈合等多種生物功能［2］，但其在NASH中的作用及機制尚不清楚。本研究以蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine and choline deficient，MCD)飲食建立小鼠NASH模型，采用殼聚糖中藥復方進行干預實驗，觀察其對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)表達的影響，為NASH治療策略的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 MCD及蛋氨酸-膽堿充足飼料均購于美國ICN生物醫學化學藥品公司;殼脂膠囊(成分為甲殼、制何首烏、茵陳、丹參、牛漆)由內蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司提供，國藥準字：Z20050665。TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購于北京華美生物工程公司。總RNA提取試劑盒、RNA酶抑制劑、AMV反轉錄酶、TaqDNA聚合酶購于Promega公司。引物序列依據Gen-Bank設計，由上海生物工程公司合成。

1.2 模型建立及標本采集 清潔級7～8周齡健康雄性C57BL/6J小鼠18只，體重18～20 g，購于白求恩國際和平醫院動物室，隨機分為3組，每組 6只。對照組以 DL-蛋氨酸(3 g/kg)和氯化膽堿(2 g/kg)充足的飼料喂養;模型組以膽堿、蛋氨酸缺乏的高脂飼料(MCD)喂養;干預組在MCD飲食基礎上加用殼聚糖中藥復方溶液0.7 g/kg灌胃，每日1次(殼脂膠囊常溫陰涼密閉保存，臨用前根據小鼠體重取所需量，將膠囊成分溶于蒸餾水2 ml中制成殼聚糖中藥復方溶液)。4周末在深度麻醉下處死各組小鼠，留取血清和肝組織。部分肝組織用10%甲醛固定，備做石蠟切片;余肝組織用液氮快速冷凍，-80℃保存，備提取RNA。

1.3 血清學檢測指標及方法 用日本Olympus AU 2700全自動生化分析儀酶法測定血清ALT、TC和TG水平;采用雙抗體夾心ABC-酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定血清TNF-α、IL-6濃度，嚴格按照說明書操作。

1.4 肝組織病理學觀察 甲醛固定肝組織標本，石蠟包埋，常規切片，HE染色，參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南》［3］光學顯微鏡下觀察肝組織脂肪變和炎癥活動程度。

1.5 肝組織TNF-α、IL-6 mRNA檢測 應用實時定量PCR。引物設計：TNF-α 上游 5’-GAACTGGCAGAAGAGGCACT，下游5’-AGAAGAGGCTGAGACATA GG C-3’;IL-6 上游 5’-TACCACTCCCAACAGACCTG-3’，下游 5’-TCTCATTTCCA CGATTTCCCAG-3’。采用Trizol試劑提取肝組織總RNA，以寡脫氧核苷酸和MMLV逆轉錄酶制備cDNA。用Taq DNA多聚酶PCR擴增cDNA產物，應用ABI PRISM 7000序列檢測系統測定mRNA轉錄數，計算mRNA拷貝和循環數的線形關系，設定標準曲線，并依此計算實驗標本mRNA的拷貝數。

1.6 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，應用Student-Newman-Keuls法進行組間比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠血清ALT、TC和TG水平的變化 與對照組比較，模型組小鼠血清ALT、TC和TG水平均顯著增高(P＜0.01)。干預組小鼠血清ALT、TC和TG水平較模型組明顯降低(P ＜0.01)。見表1。

2.2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量變化比較 造模4周后，與對照組相比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6含量均明顯增高(P＜0.01)，干預組小鼠血清TNF-α、IL-6含量較模型組顯著下降(P＜0.01)。見表2。

表1 3組實驗小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

表1 3組實驗小鼠血清ALT、TC和TG水平n=6，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

組別 ALT(U/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L)34±6 1.45±0.27 0.57±0.05模型組 115±7* 4.56±0.57* 1.17±0.11*干預組 75±6# 2.96±0.28# 0.91±0.08對照組#

表2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

表2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6含量n=6，pg/ml，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

IL-6對照組組別 TNF-α 13.6±0.9 22.6±2.5模型組 32.6±1.1* 34.3±1.2*干預組 22.8±0.9# 27.0±1.2#

2.3 3組小鼠肝組織病理變化 對照組小鼠肝組織病理學無明顯異常。模型組小鼠肝組織可見大泡性脂肪變、氣球樣變，小葉內可見點狀或灶狀炎細胞浸潤、壞死(箭頭所示)，殼聚糖中藥復方組小鼠肝組織脂肪變、炎癥程度較模型組明顯減輕(圖1)。

圖1 3組小鼠肝細胞脂肪變、炎癥活動情況(HE×200)

2.4 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA表達比較 與對照組相比，模型組小鼠肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達顯著增強(P＜0.01);與模型組相比，干預組小鼠肝組織 TNF-α、IL-6mRNA表達明顯下降(P＜0.01)。見表3。

表3 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA的表達n=6，±s

表3 3組小鼠肝組織TNF-α和IL-6 mRNA的表達n=6，±s

注：與對照組比較，*P ＜0.01;與模型組比較，#P ＜0.01

mRNA IL-6 mRNA對照組組別 TNF-α 1.13±0.13 1.13±0.12模型組 4.83±0.37* 4.02±0.52*干預組 3.28±0.39# 2.58±0.54#

3 討論

隨著飲食結構的西化和生活方式的改變，NASH的發病率日益增高［4］，美國有將近1/3成年人患有NASH，我國的發病率約占15%［5］。其發病率在肥胖、糖尿病、高血壓人群中更高。大量研究顯示，NASH不僅可導致嚴重肝病，而且與動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高發密切相關。因此，非酒精性脂肪性肝炎的有效防治對于阻止慢性肝病的進展并改善預后具有十分重要的意義。目前臨床缺乏高效、無毒副作用的抗脂肪性肝炎的西藥，中藥復方凸顯了其多組分、多途徑、多靶點的治療作用，成為目前研究的熱點。

在本實驗中采用MCD飲食喂養雄性C57BL/6J小鼠4周后，與對照組相比，模型組小鼠肝細胞出現大泡性脂肪變、肝小葉內可見點狀或灶狀炎性細胞浸潤和壞死，同時血清ALT、TC和TG水平明顯升高，說明MCD飲食成功誘導出了具有典型臨床特征的NASH模型。血清ALT水平是代表肝損傷的靈敏指標［6］，主要存在于肝細胞的胞質中，能夠反映肝細胞的完整性，其水平增高往往說明肝實質細胞受損。應用殼聚糖中藥復方預處理后，肝脂肪變性、炎癥反應程度明顯減輕，并能一定程度上抑制轉氨酶的升高，顯示其對肝臟具有一定的保護作用。

肝臟是體內參與脂質代謝的重要場所，各種致病因素如長期高脂飲食可通過一個或多個環節導致肝細胞內TC、TG的異常堆積。其中TG是NASH患者肝臟內蓄積的主要脂質，而TC和游離脂肪酸，特別是蓄積于線粒體內的部分，作為攻擊性脂質可以促進活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成和TNF-α的激活，進而導致肝臟損傷。因此，肝臟脂肪沉積是發生脂肪性肝炎的前提條件，輕微的重疊損傷就可誘發其產生NASH［7］。本研究中，模型組小鼠血清 TC、TG明顯增加，肝組織病理出現大泡性脂肪變，說明肝臟脂質代謝發生了障礙，導致肝臟脂肪浸潤及脂肪性肝炎。干預組小鼠血清TC、TG水平較模型組均明顯下降，說明殼聚糖可減少肝內脂肪沉積、改善脂質代謝紊亂。其降脂的可能機制為：殼聚糖具有粘滯性，在胃中能與胃酸作用形成凝膠，從而延緩胃排空;吸附膽汁酸和膽固醇，減少腸道對膽固醇和膽汁酸的吸收;刺激腸道食物源性脂質的排泄，從而達到治療 NASH的效果［8，9］。

近年來，細胞因子在肝臟疾病中的作用已受到密切關注。從肝細胞脂肪變性到脂肪性肝炎、肝纖維化乃至肝硬化的進展過程中，TNF-α、IL-6、瘦素、脂聯素、白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)等細胞因子都起了重要作用［10］。TNF-α是具有免疫效應和炎性反應雙重作用的細胞因子，在肝臟主要由激活的Kupffer細胞產生。TNF-α可促進外周組織脂肪動員，使血中游離脂肪酸增加，肝細胞TG的合成及聚集增加［11］;而增加的游離脂肪酸又可使TNF-α表達增加，通過激活核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)而觸發 IL-6 等細胞因子的分泌和ROS產生增多，引起脂質過氧化，導致肝細胞膜破壞和炎癥反應，形成一個自我反饋的惡性循環［12］。TNF-α表達水平與體內脂質含量、肥胖程度及胰島素抵抗程度呈正相關［13］。IL-6亦是一種具有多種生物活性的細胞因子，廣泛表達于脂肪組織、肝細胞和Kupffer細胞等中。IL-6可通過促進巨噬細胞釋放 TNF-α，刺激肝細胞分泌 C-反應蛋白、纖維蛋白原而發揮致病作用。有研究表明，NASH患者肝臟IL-6的表達較單純性脂肪肝患者明顯升高，且升高的IL-6可促進脂肪酸分解和游離脂肪酸的釋放，直接增加肝臟TG的貯積，與TC、TG關系密切［14-16］。本研究顯示，采用MCD飲食喂養小鼠4周后，模型組小鼠肝組織和血清中TNF-α與IL-6的含量較對照組明顯升高，表明TNF-α和IL-6參與了脂肪性肝炎的形成與進展過程。應用殼聚糖中藥復方干預后，實驗小鼠無論是血清中TNF-α、IL-6的含量還是肝組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達水平均較模型組明顯下降，說明殼聚糖中藥復方可降低TNF-α和IL-6的分泌，減少炎性細胞的浸潤，繼而發揮治療NASH的作用。Zhou等［17］亦證實，殼聚糖可通過影響脂肪源性激素TNF-α、瘦素等的分泌來增加胰島素的敏感性，從而緩解胰島素抵抗，與我們的研究結果相似。

綜上所述，殼聚糖中藥復方可通過改善肝功能、糾正脂代謝紊亂、抑制TNF-α和IL-6的分泌、減輕炎性反應等多種途徑來阻止或延緩NASH的發生發展，是防治脂肪性肝病的有效措施之一。

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