妊娠期糖尿病大鼠胎膜中水通道蛋白8mRNA的表達

劉廣智 劉金梅 王志軍 郭小麗 姚玉潔

妊娠期糖尿病是指妊娠期間首次發生或發現的糖耐量異常。研究發現，在人和多種動物胎盤和胎膜內有水通道蛋白的表達［1，2］，他們屬于近年發現的一組選擇性轉運水的跨膜蛋白家族(稱為水通道蛋白家族AQPS)的成員。本研究通過RTPCR法檢測水通道蛋白8(AQP8)mRNA在妊娠期糖尿病大鼠胎膜中的表達情況，探討糖代謝異常導致的羊水過多是否與AQP8基因的改變有關，為闡明糖代謝導致的水平衡紊亂的分子機制提供理論依據，同時也為這種因代謝異常導致的水平衡紊亂提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 造動物模型：選取健康成年SD大鼠，雌雄兼備，體重180～220 g，由北京華阜康公司提供，采用引導圖片方法確定大鼠的動情周期，將處于動情前期的雌、雄鼠按1∶1合籠，次晨檢查陰道口及墊料，觀察是否有陰栓存在，有陰栓者定為懷孕第1天，分開雌、雄鼠。模型鼠于妊娠第5天一次性尾靜脈注射鏈脲菌素(STZ)35 mg/kg，注射72 h后，測空腹血糖(FGB)，穩定在13.5 mg/L以上者為糖尿病模型造模成功，共30只，做模型組。選取30只正常妊娠大鼠做對照組。

1.1.2 標本采集：妊娠第19天于無菌條件下獲取模型組和對照組大鼠胎膜組織大小1 cm×1 cm，DEPC水沖洗干凈去除血液，濾紙吸去多余水分，立即放入液氮中，轉運至-80℃保存。

1.1.3 主要試劑：RNA提取試劑Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司，逆轉錄酶(AMV-RT)、核糖核酸酶抑制劑(RNasin)、Dntp、Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、隨機引物(Random primers)均購自美國 Promega公司，DNA Marker為MBI Fermentas公司產品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因及內參引物的合成：引物序列上游引物：5’ggt gga cac ttc aac cct gc-3’，下游引物：5’ggg ccc agc cag tag atc ca-3’，依據文獻［3］設計，由上海生物工程公司合成。

1.2.2 細胞總RNA提取及完整性檢測：取胎膜組織50 mg，加入1 ml RNA提取液(Trizol)，在冰浴勻漿器研磨后分裝于2個EP管中，加入200 μl氯仿，震蕩、多次離心后，將RNA提取液4 μl與上樣緩沖液2 μl混勻，1.5%瓊脂糖凝膠(含 EB)電泳分離，凝膠呈像系統觀察結果，可見5、18、和28 s 3條帶，表明RNA無降解。

1.2.3 提取RNA，用756型紫外分光光度計測量 OD260/OD280比值，定量分析RNA含量。合成cDNA，PCR擴增目的基因和β-actin用作內參照。

1.2.4 RT-PCR產物分析：用UVP凝膠圖像成像系統拍攝打印實驗結果，用凝膠圖像分析系統(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析結果。

1.3 統計學分析應用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，采用完全隨機設計的單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組AQP8 mRNA表達情況 AQP8 mRNA在428 kD上有條帶出現，在對照組和模型組孕鼠胎膜中均有表達。見圖 1、2。

圖1 AQP8 mRNA在妊娠期糖尿病大鼠胎膜中的表達

圖2 AQP8 mRNA在正常孕鼠胎膜中的表達

2.2 2組AQP8 mRNA/β-actin的IOD值比較 模型組AQP8 mRNA/β-actin mRNA明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 2組大鼠AQP8mRNA/β-actin的IOD值n=30，±s

表1 2組大鼠AQP8mRNA/β-actin的IOD值n=30，±s

組別 AQPs/β-actin IOD值 F值 P值0.6562±0.0451 1.1073±0.1494 8.362 ＜0.05模型組對照組

3 討論

羊水的胎膜內吸收即羊水通過胎盤胎兒面的絨毛膜羊膜跨膜轉運到胎兒血循環中，又稱膜內轉運途徑。最近大量研究證明羊水膜內吸收是調節羊水平衡的根本因素之一［2，4，5］。動物實驗表明，羊水通過絨毛膜羊膜的通透性，遠大于羊水以簡單擴散方式通過細胞膜的脂質雙分子層。這種絨毛膜羊膜跨膜轉運途徑是通過存在于絨毛膜羊膜中的功能性水通道蛋白(aquaporin AQP)來實現的［4］。

水通道蛋白廣泛分布于機體組織細胞中，主要介導水分子及其他小分子的跨膜轉運。AQP表達或功能的改變不僅對水分子的轉運產生影響，也與許多水代謝性疾病有關，其參與母-胎間的液體交換，與羊水的形成、成分及羊水量有關［6］。妊娠期糖尿病患者表現為明顯的水代謝紊亂，大約有10%左右的妊娠期糖尿病會伴隨羊水量的異常，表現為羊水過多［6］。在其胎盤、胎膜中是否存在有AQP的表達和功能變化，以及這些變化是否與妊娠期糖尿病的發生發展有關，值得關注。

目前發現的水通道蛋白亞型主要為 AQP1、3、4、8、9。有研究發現，AQP8在人和羊的胎盤、羊膜、絨毛膜上均有表達［7］。研究表明，AQP3和AQP8人和羊胎盤的滋養細胞上表達，且在羊胚胎的發育過程中，AQP的表達高峰與羊水最大循環量的時期一致［8］。張睿等［9］用RT-PCR方法證實了正常足月妊娠的羊膜和絨毛膜上AQP1、3、8、9均有表達，提示他們都是介導羊水通過膜內途徑重吸收的重要通道，在羊水量和成分的平衡調節中發揮作用。同時，國內外許多研究也提出了其他幾種水通道蛋白亞型可能參與各種水代謝紊亂。

本研究通過RT-PCR技術對比了水通道蛋白在正常孕鼠及GDM大鼠胎膜上的表達差異，表明AQP8在正常孕鼠及GDM大鼠胎膜上均有表達，其在妊娠期糖尿病胎膜上較正常孕鼠胎膜上表現為表達明顯減弱。推測AQP8缺失可能導致羊水量增多，滲透壓增高，糖代謝異常導致的羊水過多可能與AQP8的基因量或其結構改變有關，AQP8可能參與了妊娠期糖代謝異常時的水平衡紊亂或為水平衡紊亂的代償性反應。

總之，水通道蛋白8mRNA在正常孕鼠及模型組大鼠胎膜中均有表達，且在模型組的大鼠胎膜上的表達水平明顯低于對照組，胎膜中水通道蛋白的分子結構、表達的強弱以及在細胞中的分布位置共同參與羊水的動態平衡。

1 Johnston H，Koukoulas L，Jeyaseelan K，et al.Ontogeny of aquaporins 1 and 3 in ovine placenta and fetel membranes.Placenta，2000，21：88-99.

2 Mann SE，Rice EA，Yang BA，et al.Expression and localization of aquaporin 1 and 3 in human fetal membranes.Am J Obstet Gynecol，2002，187：902-907.

3 Wang S，Chen J，Au KT，et al.Expression of aquaporin 8 and its up-regulation by cyclicadenosine monophosphate in human WISH cells.Am J Obstet Gynecol，2003，188：997-1001.

4 Shioji M，Fukuda H，Kanzaki T，et al.Reduction of aquaporin-8 on fetal membranes under oligohydramnios in mice lacking prostaglandin F2 alpha receptor.J Obstet Gynaecol Res，2006，32：373-378.

5 Edashiqe K，Ohta S，Tanaka M，et al.The role of aquaproin 3 in the movement of water and cryoprotectants in mouse morulae.Biol Reprod，2007，77：365-375.

6 Beall MH，Wang S，Yang B，et al.Placental and membrane aquaporin water channels：Correlation with amniotic fluid volume and composition.Placenta，2006，24：1-8.

7 Wang S，Su Y，Fang R，et al.Cloning and expression of aquaporin 8 water channel in ovine and human chorioamiotic membranes：molecular mechanism of the intramembranous pathway for amniotic fluid resorption(abstract).J Soc Gynecol Investig，2000，7：183A.

8 Shengbiao W，Jiexiong C，Bing H.Cloning and cellular expression of aquaporin 9 in ovine fetal membranes.Am J Obstetr Gynecol，2005，193：841-848.

9 張睿，楊東梓，劉穎琳，等.水通道蛋白-1、3、8、9mRNA在人胎膜中的表達.南方醫科大學學報，2007，27：702-704.