5種中藥不同組合抑制小鼠S180肉瘤及抗血管生成作用的比較研究*

楊 峰，高啟龍，姚亞民，劉曉莉，田同德

(鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結合科，鄭州 450008)

隨著分子生物學的研究進展，中醫(yī)藥對腫瘤的影響也從免疫功能調節(jié)研究發(fā)展到新的治療靶點——抗腫瘤血管生成。隨著對腫瘤血管形成機制的深入研究和其抑制劑的開發(fā)，許多學者開始研究中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成作用，雖然研究血管生成的方法、藥物很多，但缺乏明確的療效和機制及用于臨床抗血管生成的中藥。尤其是目前對中藥抗血管生成的研究側重于中藥單體或單味中藥研究，復方中藥研究血管生成的很少，即使有也是對中藥成方的驗證。在前期研究中，我們從文獻中篩選出19種抗血管生成的中藥單體，又運用雞胚絨毛尿囊膜法對這19種中藥單體抗血管生成的功效進行了比較，確定了藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素、青蒿琥脂、苦參堿這5種中藥抗血管生成能力最強。還運用雞胚絨毛尿囊膜法和體外抗血管生成法，比較了這5種中藥不同組合抗血管生成的效果。本研究繼續(xù)運用小鼠體內腫瘤實驗進一步比較這5種中藥不同組合的抗腫瘤血管生成作用，從而開發(fā)出確有療效的抗腫瘤血管生成中藥復方新藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 清潔級健康雌性昆明小鼠，4～6周齡，體重25g±3g，購自鄭州大學河南省實驗動物中心(合格證號2011-097)。分籠飼養(yǎng)，自由進食水，飼養(yǎng)間溫度控制在21℃ ±2℃，相對濕度控制在50%～60%。小鼠S180肉瘤細胞株購自中科院上海生化細胞所。

1.1.2 藥物與試劑 藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素、青蒿琥脂、苦參堿均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，沙利度胺為常州第四藥廠有限公司產品。兔抗鼠 CD31抗體購自美國 Biolegend公司，SABC試劑盒及DAB購自中科院上海細胞所，由河南省腫瘤研究所儲存。

2 方法

2.1 荷瘤小鼠模型的建立

冷凍保存的腹水型S180細胞體外復蘇，2000r/min離心5 min棄上清液，用無菌生理鹽水稀釋，調整瘤細胞至2×109/L，取5只健康昆明種小鼠，每只用上述細胞懸液0.4ml，ip，7d～10d后接種小鼠腹部明顯增大、凸出。將其麻醉處死，無菌抽取乳白色腹水液，以生理鹽水1∶1稀釋，經臺盼藍染色后計算活細胞數95%，調整瘤細胞密度為2×109/L，64只小鼠右后肢腹股溝部皮下接種0.2ml，4d～5d后形成直徑約6mm大小皮下腫瘤的小鼠作為荷瘤鼠。

2.2 分組與給藥

建立荷瘤小鼠模型并隨機分為7組，每組8只。A組:生理鹽水組;B1-5組:為5種中藥的不同組合，劑量分別為藤黃酸32mg/kg/d，斑蝥素2mg/kg/d，人參皂苷 20mg/kg/d，青蒿琥脂 50mg/kg/d，苦參堿50mg/kg/d。按上述劑量給藥組合如下:B1組:藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素;B2組:藤黃酸、人參皂苷、青蒿琥脂;B3組:斑蝥素、人參皂苷、青蒿琥脂;B4組:藤黃酸、人參皂苷;B5組:藤黃酸、苦參堿;C組:沙利度胺50mg/kg/d。取上述7組藥物灌胃，連續(xù)10d。

2.3 各組腫瘤體積和腫瘤質量觀察

給藥結束第2天處死小鼠，測量小鼠腫瘤質量與體積，腫瘤體積公式V=長×寬 ×0.5計算，并取腫瘤稱重。腫瘤抑制指數H=(V對照組-V實驗組)/V對照組×100%。

2.4 各組腫瘤微血管密度檢測

處死小鼠，切取腫瘤組織、固定、包埋、切片，行免疫組化檢查。免疫組化檢查采用SABC法，按試劑盒操作說明進行。一抗為兔抗鼠CD31抗體，用PBS代替一抗作為陰性對照，瘤旁正常組織作為陽性對照。計數方法選擇腫瘤組織細胞間質內孤立的棕黃色的血管內皮細胞或細胞簇或血管腔內徑小于8個紅細胞者代表一條單獨的微血管。先在低倍視野下找到腫瘤組織內微血管密度最高的區(qū)域，然后在200倍視野下計數5個視野的微血管數目，取平均值，計算微血管密度。

3 統(tǒng)計學分析

4 結果

4.1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤生長的抑制作用及抑制率

表1顯示，A組移植瘤體積增長較快，而各治療組移植瘤體積增長緩慢，C組和B1組最明顯。實驗結束時各組裸鼠的體重無明顯差別，與實驗前比較有增長但改變不明顯，B1到B5組移植瘤平均體積和平均瘤質量與A組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據腫瘤質量和體積計算，B1組藥物對小鼠S180肉瘤生長抑制率分別為45.80%和45.31%，各治療組小鼠飼養(yǎng)中未見藥物不良反應。

4.2 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤血管生成的影響

表1顯示，經抗 CD31抗體免疫組織化學染色，陽性信號位于細胞質和細胞膜，腫瘤組織內的血管內皮細胞呈棕色或棕黃色。各組移植瘤均有 CD31標記的新生血管表達，腫瘤組織邊緣 MVD高于中央。以 A組中 MVD最高達39.92±7.97，從 B1到B5組 CD31表達逐漸減少，C組 MVD最低 僅為17.45±3.99。由5種中藥不同組合的 B1到 B5組與 A組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。

表1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤及血管生成的抑制作用(±s，n=8)

表1 5種中藥不同組合對小鼠S180肉瘤及血管生成的抑制作用(±s，n=8)

注:#P ＜0.05，compared with NS group;MVD:microvessel density;IR:Inhibition rate;TV:Tumor volume;TW:Tumor weight

Group TV(cm3) TVIR(%) TW(g) TWIR(%)MVD A 1.31±0.59 0 1.92±0.79 0 39.92±7.97 B1 0.71±0.23* 45.80 1.05±0.42# 45.31 20.42±5.24#B2 0.72±0.35△ 45.04 1.09±0.57# 43.23 23.50±6.79#B3 0.74±0.49 43.51 1.12±0.48# 41.67 25.16±7.06#B4 0.75±0.31 42.73 1.19±0.74# 38.02 26.77±4.93#B5 0.79±0.65# 39.69 1.23±0.69# 35.94 29.77±5.71#C 0.67±0.42* 48.85 0.98±0.31# 48.95 17.45±3.99#

5 討論

腫瘤血管生成(Angiogenesis)由 Folkman［1］于20世紀70年代提出，是實體腫瘤賴以生存的微循環(huán)模式，能為腫瘤提供各種養(yǎng)分，促進腫瘤的生長和轉移。若沒有血管形成，腫瘤的營養(yǎng)供給及代謝物排泄僅能靠簡單的物理彌散，這極大限制了腫瘤細胞生長，腫瘤呈靜息狀態(tài)達數月乃至數年之久，直徑只能維持在2mm～3mm以內而不表現明顯的臨床癥狀［2］。因此，腫瘤血管生成是腫瘤持續(xù)生長、侵襲轉移的物質基礎。抗血管生成為腫瘤的治療提供了新的契機，與傳統(tǒng)的腫瘤治療相比它具有特異性強、正常組織不易受損、不易發(fā)生耐藥、抗瘤譜廣等優(yōu)勢。隨著分子生物學的發(fā)展，人們試圖尋找抗腫瘤血管生成作用強且毒副作用小的新型抗血管生成藥物，中草藥及其提取物逐漸受到重視。雖然目前研究中醫(yī)藥抗血管生成的文獻很多，但臨床實用確有療效的中藥抗血管生成制劑很少。

我們前期研究運用雞胚絨毛尿囊膜法，從文獻報道中選出具有抗血管生成作用的19種中藥，但這些中藥或提取物都未運用于臨床，原因可能是雖然實驗中具有抗血管生成作用，但臨床應用后抑制血管生成效果并不明顯;雖然文獻報道這些藥物具有抗血管生成效應，但并沒有進行比較哪些中藥抗血管生成作用最強，以及我們在這些藥物研究的基礎上如何研發(fā)出抗腫瘤血管生成作用更強的藥物并能運用于臨床。從文獻報道來看，這19種中藥提取物都具有抗血管生成的作用，沒有比較就沒有鑒別，沒有比較就不能開發(fā)出切合臨床實用的抗血管生成中藥新藥。前期研究結果表明(另行發(fā)表)，去甲斑蝥素、人參皂苷、苦參堿、青蒿琥脂、藤黃酸5種中藥對CAM血管生成具有明顯的抑制作用，表現為 CAM新生血管密度降低，管徑變細，血管分布雜亂，部分血管出現斷裂，顏色變淺。CAM照片經計算機分析表明，5種中藥抑制血管生成能力的順序為藤黃酸＞人參皂苷＞青蒿琥脂＞苦參堿＞斑蝥素。

為進一步提高中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成的療效，我們在前期研究的基礎上對已經篩選出的療效較強的中藥進行了重組，希望找到療效較強的抗腫瘤血管生成的中藥組合。根據實驗結果，藤黃酸、人參皂苷、斑蝥素組合抗腫瘤血管生成能力最強，藤黃酸、人參皂苷、青蒿琥脂組合次之，第三是斑蝥素、人參皂苷、青蒿琥脂組合，第四是藤黃酸、人參皂苷組合，第五是藤黃酸、苦參堿組合。在抗腫瘤血管生成效應最強的這一組合中的藥物，已有文獻報道這些藥物對多種腫瘤都有抗血管生成作用，其中藤黃酸抗血管生成的能力較強，這與Yi T等的研究結果一致［3］。人參皂苷也有明確的抗血管生成作用［4］，去甲斑蝥素對乳腺癌和膽囊癌也都有明顯的抗血管生成效應［5、6］，這為我們進一步的臨床研究奠定了深厚的基礎。

因此，有效的抗腫瘤中藥的篩選、提煉和重組，給抗腫瘤血管生成治療開辟了新的前景，但中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成的研究還有很多問題需要解決。主要有多味中藥的不同組合及1味藥在多個方劑中抗腫瘤血管生成的作用機制是什么?為什么單純中藥抑制腫瘤血管生成療效欠理想?中藥的作用效力如何提高?因此筆者認為，我們的下一步任務是在當前中醫(yī)藥抑制血管生成進展基礎上，利用現代醫(yī)學研究手段，繼續(xù)對能抑制血管生成的中藥單體進行篩選、重組和研發(fā)，使我們更進一步地對當前的科研成果進行總結和升華，深入挖掘中醫(yī)藥抑制腫瘤血管生成的優(yōu)勢和潛能。而多層面、多學科相結合將中醫(yī)藥抗腫瘤血管生成機制研究推向一個新的水平，開發(fā)出有確切療效且能在臨床上應用的中藥單體或復方血管生成抑制劑，以進一步提高腫瘤的治療效果，延長患者的生命，從而使中醫(yī)藥更好地為廣大腫瘤患者服務。

［1］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21):1182-1186.

［2］Folkman J， BronderT， Palmblad J， etal. Angiogenesis research:guidelines for translation to clinical application［J］.Thromb Haemo，2001，86(4):23-33.

［3］Yi T，Yi Z，Cho S-G，et al.Gambogic acid inhibits angiogenesis and prostate tumor growth by suppressing vascular endothelial growth factor receptor 2 signaling［J］.Cancer Research，2008，68(6):1369-1377.

［4］辛穎，姜新，崔俊生，等.20(S)-人參皂苷 Rg3對血管內皮細胞增殖和遷移的抑制作用［J］.腫瘤防治研究，2010，37(12):1352-1355.

［5］范躍祖，陳春球，趙澤明.去甲斑蝥素對膽囊癌腫瘤血管生成的作用及機制研究［J］.中華醫(yī)學雜志，2006，92(10):693-699.

［6］林曉燕，宋和平，胡赟宏.去甲斑蝥素對人乳腺癌血管生成的抑制作用［J］.中國癌癥雜志，2007，17(11):847-850.