禽流感抗原基因NA導入生菜的研究

范亞麗 ，李 進，阮 穎，劉春林

（1.阜陽師范學院生命科學學院，安徽 阜陽 236037；2.新疆建設兵團農一師十三團，

新疆 阿克蘇 843302；3.湖南農業大學作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南 長沙 412328）

高致病力禽流感（High pathogenic avian fluenza，HPAI）是由A型流感病毒中的一些H5和H7亞型病毒引起的具有高度傳染性、危害機體多種器官、高死亡率的禽類的一種系統性疾病，已被國際獸疫局列為A類烈性傳染病[1-3]。自1905年禽流感病原被確認后，世界上共暴發了18次HPAI，其中8次是由H5亞型、10次是由H7亞型HPAIV引起的，給養禽業造成極大的經濟損失[4]。禽流感病毒屬正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒，基因組由8個分節段單股負鏈RNA組成，編碼至少10種蛋白質[5]。第6節段RNA編碼的神經氨酸酶（NA）是病毒囊膜表面的一種糖蛋白，其主要作用是水解細胞表面受體糖蛋白末端的N2乙?；窠洶彼?，以利于子代病毒的成熟和轉移[6]。NA是誘導體液免疫的靶抗原之一，通過誘導機體產生特異性抗體，抑制病毒從感染細胞中釋放，降低病毒在體內的復制，進而產生抗病毒作用[7]。用NA基因構建的DNA疫苗免疫動物，能誘導抗流感病毒致死攻擊的免疫保護[8]。

生菜（Lactuca sativa var.capatata L.）為菊科萵屬植物，是一種由國外引進的生食蔬菜，具有較高的營養價值，生長周期短，苣整株可以生食，再生和轉化率較高，是一種用來表達外源蛋白的良好宿主植物。筆者采用農桿菌介導法將含有禽流感抗原基因NA的表達載體導入外植體生菜，初步研究了禽流感抗原基因NA在生菜基因組中的表達，旨在為以生菜作為植物生物反應器應用于大規模生產異源蛋白或疫苗提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 生菜（Lactuca sativa var.capatata L.），品種：玻璃生菜（湖南農業大學作物基因工程實驗室）。

1.1.2 菌株和載體 含目的DNA片段表達載體pBI121-NA的農桿菌菌株：Agrobacterium tumefaciens LBA4404。表達載體pBI121-NA由湖南農業大學作物基因工程實驗室提供，李進[9]構建。表達載體pBI121-NA結構如圖1所示。

圖1 表達載體pBI121-NA結構

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 選取顆粒飽滿的玻璃生菜種子，先用75%酒精浸泡30 s，再用40 mL 5%NaClO加入2滴吐溫溶液浸泡15 min，無菌水沖洗3～5次，將種子均勻播種于1/2 MS培養基上，每個培養皿200粒，置于25℃光照培養，2～3 d獲得培養一致的無菌苗。

1.2.2 農桿菌工程菌的準備 取攜帶pBI121-NA質粒的農桿菌LBA4404單菌落接種于3～5 mL含Kan、Str和Rif 3種抗生素YEB液體培養基中，于28℃、250 r/min振蕩培養過夜；取培養液1 mL加入到含3種抗生素的50 mLYEB液體培養基中，28℃、250 r/min振蕩培養4 h；測量菌液濃度OD600值，選取合適濃度的菌液4℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄去上清液，用50 mL滲透液體培養基重懸菌體，備用。

1.2.3 子葉浸染轉化 將生長2～3 d的生菜，利用子葉浸染轉化法進行生菜的遺傳轉化。在重懸的菌液中加入0.05%β-巰基乙醇和100 mmol/L的AC混勻；然后用子葉放進OD600值為0.4～0.6菌液中浸染15 min，平放到共培養基上共培3 d；轉入到誘導分化培養基上培養，兩周后，將分化出的芽轉移到苗生長培養基上，兩周壯苗后，轉入生根培養基；待苗長出發達的根系時，打開封口膜1 d，再將幼苗轉入到蛭石固體培養基中煉苗一周；一星期后移栽到營養土中，移栽苗生長期間每3 d澆1次1/10 MS營養液，再經15 d左右移入大田。

1.2.4 轉化植株的檢測 （1）PCR擴增檢測：根據目的片段的核苷酸序列設計引物，擴增481 bp的序列，引物序列如下。

NA_FB：5′-GAAGATCTTCATGAATCCAAATC AGAAGATAACAACCAT-3′

NA_RM：5′-CTCATTAATGTTCTGTGAGGGCT TCTG-3′

PCR反應體系為25 μL，反應條件：94℃預變性 4 min；94℃變性 40 s；60℃退火 40 s；72℃延伸120 s，共35個循環。72℃延伸7 min，16℃保存。

（2）RT-PCR檢測：以未轉基因的生菜葉片，轉基因生菜葉片為材料，用RNA提取試劑盒進行生菜總RNA的提取，用Pronege DNAse試劑盒消化總RNA中含有的DNA，進行逆轉錄合成cDNA。分別以未轉基因生菜葉片、轉基因生菜葉片、未檢測到目的片段的抗性生菜的反轉錄后cDNA、含目的片段DNA以及水為模板，以NA_FB，NA_FM為引物，進行PCR擴增。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素和頭孢霉素對生菜子葉分化能力的影響

生菜對卡那霉素（Kan）有一定的抗性，Kan對不定芽的誘導影響較大，明顯表現出對生菜子葉分化的抑制作用，隨Kan濃度升高，不定芽的誘導率以及平均出芽數逐漸降低。圖2結果顯示，當Kan濃度為80 mg/L時，不定芽的誘導率由對照的100%降低到85.4%，開始影響子葉的分化，平均出芽數由5.43個降低到2.85個；當Kan濃度達到100 mg/L時，不定芽的誘導和出芽數也大幅度減少；當Kan濃度為120 mg/L時，完全抑制生菜不定芽的誘導。因此，選擇Kan 120 mg/L為誘導分化的篩選濃度。頭孢霉素（Cef）對生菜植株的再生的抑制作用不是很明顯，但仍然表現為隨著抗生素濃度的提高，不定芽的誘導率逐漸降低，表明生菜對頭孢霉素的抗性仍然能達到400 mg/L。因此，可以使用Cef作為農桿菌的生長抑制劑。

圖2 抗生素對生菜子葉再生的影響

2.2 頭孢霉素對生菜轉化的影響

在農桿菌介導法轉化生菜的過程中，抑菌是轉化是否成功的一個關鍵因素[10]。圖3結果表明：頭孢霉素對生菜本身的選擇壓不明顯，但隨著抗生素濃度的提高，不定芽的誘導率逐漸降低，可選擇頭孢霉素抑制農桿菌生長達到試驗目的。Cef濃度為50 mg/L時，抑菌率為58%；Cef濃度達到100 mg/L時，抑菌率為100%，當抑菌劑濃度更高時，抑菌率均達到100%。試驗確定Cef的抑菌濃度為100 mg/L。

2.3 轉基因生菜的檢測

圖3 頭孢霉素對生菜轉化的影響

2.3.1 抗性苗的PCR檢測 把得到的抗性苗提取DNA作為模板，用2對篩選引物做PCR擴增，結果如圖4所示：1～14泳道為提取DNA作為模板擴增結果，其中15泳道為對照（非轉化植株），16泳道為質粒陽性對照，陽性植株的目的片段大小為481 bp，擴增帶與預期大小相符。說明1、6、14泳道為轉基因苗。圖4中以不同轉基因植株總DNA為模板進行PCR擴增，各帶亮度不一，可能是受DNA提取純度或基因在植物中的拷貝不同的影響。

圖4 卡那霉素抗性苗的PCR檢測

2.3.2 轉基因生菜總RNA的提取 用試劑盒將總RNA抽提完成后，用紫外熒光光度計測定OD260和OD280，結果OD260/OD280為1.9，表明所提取的總RNA純度較高。取10 μg RNA在無RNA酶的1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，結果如圖5所示，1泳道為轉基因生菜總RNA，2泳道為未轉基因生菜總RNA。從圖中可以看出1、2泳道中RNA樣品沒有降解，完全符合進行做反轉錄的要求。

圖5 生菜總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

2.3.3 轉基因生菜RT-PCR檢測 分別以轉基因生菜葉片、未轉基因生菜葉片、未檢測到目的片段的抗性生菜反轉錄后的cDNA、含目的片段DNA以及水為模板，經過PCR擴增得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖6）。研究結果表明：5泳道為以含目的片段DNA為模板作陽性對照，其擴增產物大小為481 bp的條帶，與marker相比較，目的片段位于300～500 bp之間，約481 bp，條帶大小與預期的一致。1泳道為以轉基因生菜反轉錄后的cDNA為模板，PCR擴增得到的產物為長約481 bp的特異性DNA片段，與陽性對照片段大小一致。2、3泳道分別為以未轉基因生菜和未檢測到目的片段的抗性生菜反轉錄后的cDNA為模板，4泳道以水為模板作陰性對照，均沒有得到與陽性對照片段大小一致的條帶。這說明目的片段只在轉基因植株中檢測到，而沒有在未轉基因植株中檢測到目的片段，證明目的基因已經整合到生菜基因組中。

圖6 轉基因苗的RT-PCR檢測

3 討論

隨著植物生物技術的發展，利用轉基因植物生產外源蛋白或可食性疫苗已成為一個重要的研究和開發領域。植物生物反應器是指通過基因工程途徑，以常見的農作物作為“細胞工廠”，通過大規模種植生產具有高附加值的醫用蛋白、疫苗、工農業用酶、特殊碳水化合物等植物反應器[11]。其最大的優點是可以大規模、廉價、安全地生產動物蛋白或疫苗[12]，特別是用于免疫和治療性疫苗的生產，已隨著研究的深入越來越顯示出其獨特的優勢[13]?；蚬こ填I域的研究進展，使得植物體正在成為具有重要經濟價值的異源蛋白（包括藥用蛋白）的生產體系。據不完全統計，迄今為止，國外已經有幾十種藥用蛋白質或多肽在植物中得到成功表達，其中包括了人的細胞因子、表皮生長因子、促紅細胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等[14]。

筆者通過農桿菌介導法轉化生菜，已經獲得卡那霉素抗性苗105株，用特異引物對抗性植株進行PCR檢測，其中6株為轉基因植株。經RT-PCR檢測可知，禽流感抗原基因NA已經在生菜基因組中得到整合并初步驗證在轉錄水平上得以表達。通過陽性株的無性繁殖可以擴大陽性植株的數量，為禽流感抗原基因NA在生菜中的表達、編碼蛋白免疫原性以及能否在后代中穩定遺傳的研究打下基礎。

[1]黃慶華，張果平，王 可.禽流感病毒NP蛋白單克隆抗體的研制和鑒定[J].江西農業學報，2010，22（12）：141-143.

[2]于 博，章振華，姜北宇，等.一株H9N2亞型禽流感病毒全基因組序列的遺傳變異分析 [J].安徽農業科學，2010，38（1）：507-509，526.

[3]Shen J，Zhang Z H，Jiang B Y，et al.Complete genome sequencing and genetic variation analysis of two H9N2 subtype avian influenza virus strains[J].Agricultural Science&Technology，2011，12（2）：291-294.

[4]Tang X Y，Tian G B，Zhao C S，et al.Isolationand characterization of prevalent strains of avian influenza viruses in China[J].Chinese Journal Animal Poultry Infection Disease，l998，20（1）：l-5.

[5]Alexander D J.A review of Avian Influenza in Different Bird Speices[J].Veterinary Micorbiology，2000，74：3-13.

[6]Palese P ，Tobita K，Ueda M ，et al.Characterization ofTemperature Sensitive Influenza Virus Mutants Defective in Neuraminidae[J].V i rology，1974，61：397-410.

[7]Webster R G，Reay P A ，Laver W G.Protection against Lethal Influenza with Neuraminidase[J].Virology，1988，164：230-237.

[8]Sandbulte M R ，J imenez G S ，Boon A C M ，et al.Cross-Reactive Neuraminidase Antibodies Afford Partial Protection against H5N1 in Mice and Are Present in Unexposed Humans[J].PLOS Medicine，2007，4：265-271.

[9]李 進，阮 穎，龔 劍，等.禽流感抗原基因NA，HA的克隆及其表達載體的構建[J].現代生物醫學進展，2008，8（3）：449-452.

[10]莽克強.農業生物工程[M].北京：化學工業出版社，1998.

[11]Oersbo M，Okkels F T.A novel principle for the selection of transgenic plant cells：positive selection[J].Plant Cell Reports，1996，16：219-221.

[13]Hiatt A，Cafferkey R，Bowdish B.Production of antibodies in transgenetic plants[J].Nature，1989，342：76-78.

[13]Tacket C O，Mason H C，Losonsky G，et al.Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato[J].Nature Medicine，1998，5（4）：607-609.

[14]Mason H S，Ball J M，Shi J J，et al.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：11745-11749.