紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡寧提取和含量測(cè)定及其穩(wěn)定性研究

謝清春 陳燕忠 呂竹芬

廣東藥學(xué)院藥物研究所，廣東廣州 510006

紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡寧提取和含量測(cè)定及其穩(wěn)定性研究

謝清春 陳燕忠 呂竹芬▲

廣東藥學(xué)院藥物研究所，廣東廣州 510006

目的測(cè)定不同產(chǎn)地的紫草中β,β'-二甲基丙烯酰阿卡寧（以下簡稱阿卡寧）的含量，比較不同溶劑對(duì)紫草中阿卡寧的提取率，并對(duì)阿卡寧的乙醇溶液穩(wěn)定性進(jìn)行考察。 方法 采用高效液相色譜法測(cè)定阿卡寧的含量，色譜柱為Dikma Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈 - 水 - 甲酸（700:300:0.5）為流動(dòng)相，流速 1mL·min-1，檢測(cè)波長275 nm。測(cè)定了內(nèi)蒙紫草、新疆紫草和云南紫草中阿卡寧的含量，考察了75%乙醇、乙醇、石油醚和液體石蠟對(duì)紫草中阿卡寧的提取率；將阿卡寧0.1 mg·mL-1乙醇溶液于冰箱4℃存放，定期進(jìn)樣測(cè)定，并與新配制時(shí)測(cè)定的峰面積比較。結(jié)果 測(cè)定的三種紫草中，以新疆紫草含量最高；乙醇和石油醚對(duì)阿卡寧的提取率高而75%乙醇和液體石蠟的提取率低；阿卡寧的乙醇溶液隨存放時(shí)間的增加而峰面積變小。 結(jié)論 提取溶劑對(duì)紫草中阿卡寧提取率影響較大；由于阿卡寧溶液的不穩(wěn)定性，選擇阿卡寧作為評(píng)價(jià)含紫草藥材制劑的指標(biāo)成分并不合適。

紫草；β,β'-二甲基丙烯酰阿卡寧；提取率；高效液相色語法；穩(wěn)定性

紫草為紫草科植物新疆紫草[1]Arnebia euchroma（Royle）Johnst.或內(nèi)蒙紫草Arnebia guttata Bunge的干燥根。有些地區(qū)也用滇紫草Osma Paniculatum Bur.et Fr.的干燥根[2]。紫草具有清熱涼血，活血解毒，透疹消斑之功效[1]。紫草的化學(xué)成分和藥理活性研究表明，紫草含有多種生理活性成分，這些成分具有抗菌抗炎[3]、抗生育[4]、抗免疫低下、降血糖、保肝護(hù)肝臟[5]等多種作用。目前對(duì)紫草中有效成分能否有效提取及提取后的穩(wěn)定性，尚未有深入的研究報(bào)道，本資料重點(diǎn)考察了紫草中的指標(biāo)成分阿卡寧的提取及其在介質(zhì)中的穩(wěn)定性。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate3000 高效液相色譜儀（Dionex Corp.），KQ-300GDV臺(tái)式恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），BA110S 電子天平（Sartorius），冰箱（松下電器有限公司）。β,β'-二甲基丙烯酰阿卡寧對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111689-200502），新疆紫草、內(nèi)蒙紫草及滇紫草（批號(hào)分別為 20060912-1、20060912-2、20060912-3，廣州致信中藥飲片有限公司）經(jīng)鑒定為正品。乙醇（分析純，廣州化學(xué)試劑廠），石油醚（60～90℃，分析純、天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），液體石蠟（分析純、天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純、廣州依能色譜有限公司），水為重蒸水。

1.2 含量測(cè)定方法

1.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取阿卡寧對(duì)照品適量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液即得。

1.2.2 供試品溶液 按中國藥典方法，取紫草粉末（過四號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入石油醚（60～90℃）25 mL，稱定重量，超聲功率 250 W，頻率 33 KHz，30 min，放冷，搖勻，精密稱定重量，用石油醚（60～90℃）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加入流動(dòng)相至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性 以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水-甲酸（700∶300∶0..5）為流動(dòng)相，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長275 nm。在此條件下阿卡寧理論塔板數(shù)高于規(guī)定要求，對(duì)照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖

1.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱定阿卡寧對(duì)照品10.854 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 0.05、0.15、0.35、0.50、0.75 mL，置 5 mL 量瓶中，加流動(dòng)相溶解，定容至刻度，分別取10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積對(duì)溶液濃度回歸分析，得回歸方程為A=48.099C-0.023 2，r=0.999 7。表明在濃度在0.01～0.15 mg/mL 范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 取同一新疆紫草供試液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定5 次，記錄色譜峰面積，供試品溶液峰面積RSD為1.46%。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取5份同一批次新疆紫草藥材粉末各0.5 g，按供試品溶液制備方法處理定，測(cè)得阿卡寧平均含量為5.421 mg/g，RSD為1.40%，表明此方法重復(fù)性良好。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量（5.421 mg/g）的新疆紫草藥材粉末0.4 g，精密稱定6 份，分別精密加入乙酰阿寧對(duì)照品2 mg，按“2.1.2供試品溶液”的制備項(xiàng)下操作至取續(xù)濾液10 mL，蒸干，溶解并轉(zhuǎn)移至20 mL的容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得阿卡寧的平均回收率為97.88%，RSD為2.36%，回收率試驗(yàn)符合要求。

2 結(jié)果

2.1 樣品含量測(cè)定

取不同品種的紫草藥材樣品，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法分別計(jì)算阿卡寧的含量[6]，結(jié)果表明測(cè)定的不同品種的紫草中阿卡寧的含量差異較大，其中新疆紫草和內(nèi)蒙紫草的含量符合規(guī)定而云南紫草含量不符合藥典“按干燥品代，阿卡寧不得少于0.3%”的規(guī)定。見表1。

表1 不同紫草中阿卡寧含量測(cè)定結(jié)果

2.2 阿卡寧對(duì)照品的穩(wěn)定性試驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn)，阿卡寧0.1 mg/mL對(duì)照品溶液存放時(shí)間越長，色譜峰面積越小，因此筆者對(duì)阿卡寧0.1 mg/mL對(duì)照品溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，存放條件為冰箱中4℃冷藏。見表2。

這表明0.1 mg/mL的阿卡寧不穩(wěn)定，存放過程中含量降低，因此對(duì)照品溶液配制后不可以長期使用。結(jié)果也提示，在提取物含有阿卡寧的制劑中，隨著制劑存放時(shí)間的增加，阿卡寧可能產(chǎn)生含量下降的變化，選擇阿卡寧作為此類制劑含量評(píng)價(jià)指標(biāo)并不合適[7]。

2.3 不同溶劑對(duì)紫草中阿卡寧提取率

為了比較不同提取溶劑對(duì)紫草中阿卡寧提取率，我們采用常用的75%乙醇、乙醇、石油醚和液體石蠟4種提取溶劑對(duì)新疆紫草的阿卡寧的提取作了比較，操作方法同1.2.2。

結(jié)果采用乙醇或石油醚提取，阿卡寧含量無明顯差異，但用75%乙醇或石蠟提取則提取率較低，提示在含紫草的中藥制劑中如用上述與兩種溶劑提取不利于有效成分的提出。見表3。這可能因?yàn)榘⒖▽幨欠菢O性物質(zhì)，脂溶性強(qiáng)，75%乙醇極性較大，阿卡寧在75%乙醇中的溶解度較小，液體石蠟雖然為非極性溶劑，但其滲透性差，因而對(duì)阿卡寧的提取率也低。

3 討論

本文研究表明液體石蠟對(duì)阿卡寧提取率低，實(shí)際生產(chǎn)中有些廠家采用液體石蠟提取紫草并不合適。對(duì)阿卡寧0.1 mg/mL對(duì)照品的乙醇溶液穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，阿卡寧乙醇溶液不穩(wěn)定，容易降解。預(yù)示在制劑中阿卡寧隨著存放時(shí)間的延長，也可能降解，選擇阿卡寧作為含紫草類藥材制劑檢測(cè)的指標(biāo)成分可能并不合適。盡管藥典規(guī)定采用阿卡寧作為紫草含量測(cè)定的指標(biāo)成分，但鑒于其在制劑中存在不穩(wěn)定的可能性[8]，建議在含紫草的制劑中選擇另一種相對(duì)穩(wěn)定的成分作為檢測(cè)的指標(biāo)成分。

表2 阿卡寧對(duì)照品溶液面積隨時(shí)間變化表

表3 不同溶劑對(duì)紫草中阿卡寧提取率

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：320.

[2]張超，何寶豐，張慶芝.昆明滇紫草的生藥學(xué)研究 [J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011， 31（7）：32-34.

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[7]賀金華，蘆韋華，王芳，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆紫草毛狀根中乙酰紫草素和β,β'-二甲基丙烯酰紫草色素的含量[J].藥物分析，2010，30（10）：1849-1851.

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Extraction and determination of β,β'-dimethylacrylalkannin in lithospermum erythrorhizon and study on its stability

XIE Qingchun CHEN Yanzhong LV Zhufen
Institute of Material Medica, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou 510006, China

Objective To determine the β,β'-dimethylacrylalkannin in lithospermum erythrorhizon, compare the extracting rate of different solvents to β,β'-dimethylacrylalkannin and study the stability of standard β,β'-dimethylacrylalkannin solution of alcohol.Methods A HPLC method was used to determine the β,β'-dimethylacrylalkannin.Dikma Diamonsil C18 chromatogram column(200 mm×4.6 mm, 5μm) was used, Acetonitrile-water-Formic acid(700:300:0.5) as mobile phase, flow rate at 1mL·min-1, detection wavelength at 275 nm.β,β'-dimethylacrylalkannin in Arnebia euchroma (Royle) Johnst,Arnebia guttata Bunge and Osma Paniculatum Bur.et Fr.was determined.The extracting rate of four solvents (75% alcohol,alcohol, petroleum ether and liquid paraffin) was studied.The 0.1mg·mL-1solution of standard β,β'- dimethylacrylalkannin was stored at 4 ℃ in Refrigerator, and was injected to the HPLC system at intervals.Results The β,β'- dimethylacrylalkannin content in Arnebia euchroma (Royle) Johnst.was the highest.Extracting rate of alcohol and petroleum ether was more than 75% alcohol and Liquid paraffin.The peak area of 0.1mg·mL-1solution of standard β,β'- dimethylacrylalkannin decreased as the storage time extended.Conclusion Since the alcohol solution of β,β'- dimethylacrylalkannin was unstable, choosing β,β'- dimethylacrylalkannin as the index component in formulations concluded Lithospermum erythrorhizon was improper.

Lithospermum erythrorhizon; β,β'- dimethylacrylalkannin; Extracting rate; HPLC; Stability

R284.2；R927.11

A

2095-0616（2012）06-26-03

▲通訊作者

2012-02-20）