益腎調周法對卵巢早衰模型大鼠卵巢儲備能力的影響

王 浩

（湖南中醫藥大學研究生院，湖南 長沙 410208）

卵巢功能早衰（premature ovarian failure, POF）是婦科的常見病之一，在一般人群中患病率為1%～3%，在40歲之前的發病率為1%，30歲之前為1‰，且發病率呈逐年上升的趨勢[1]。POF不僅可直接導致患者不孕、月經稀發、最終閉經，并且病程中常常伴隨著煩躁、抑郁、甚至敵對等情緒改變，同時內外生殖器官及第二性征逐漸萎縮及退化[2]，并引起脂質代謝紊亂，誘發高脂血癥、動脈硬化、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等。因此，POF的防治是當今生殖醫學研究的重點及難點。女性生育功能主要體現在卵巢的儲備能力上（ovarian reserve），所以如何準確預測卵巢儲備能力，亦是防治POF的重要指標。本研究以付霞霏、何援利（2008年）建立的《化療所致卵巢早衰動物模型的建立》為基礎，旨在觀察益腎調周法對卵巢儲備能力的影響，探討其量效關系及作用機理，為中藥防治POF提供科學有效的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級健康雌性8周齡SD大鼠135只，質量180 g士20 g，由河南省動物實驗中心提供。動物合格證號：SCKx-（豫）2010-002。飼養室溫控制在20～25℃，光照12 h,采用分籠架式喂養，標準飼料，飲水為自來水。

分組 將135只大鼠按質量分層隨機（隨機數字表法）分組，隨機分為9組,即空白對照組（A）、模型對照組（B）、克齡蒙對照組（C）、滋腎填精湯高劑量組（D1）、滋腎填精湯低劑量組（D2）、溫腎填精湯高劑量組（E1）、溫腎填精湯低劑量組（E2）、益腎調周法高劑量組（F1）、益腎調周法低劑量組（F2），每組15只，分籠常規喂養。

1.1.2 實驗藥物 滋腎填精湯（熟地，黃精，女貞子，白芍，當歸，淮山藥，山茱萸，川芎，合歡皮，炙甘草），由河南中醫學院藥理實驗室制備，采用乙醇回流提取法，調整至含生藥2 g/mL。

溫腎填精湯（菟絲子，淫羊藿，仙茅，桑寄生，川斷，巴戟天，何首烏，黃精，合歡皮，杜仲，木香，炙甘草），由河南中醫學院藥理實驗室制備，采用乙醇回流提取法，調整至含生藥2 g/mL。

克齡蒙（Climen）：拜耳醫藥保健有限公司，片劑，21片/盒。

1.1.3 主要試劑 環磷酰胺（Cyclophosphamid，CTX）：山西普德藥業有限公司，粉劑，200 mg/支。

大鼠雌二醇（E2）放免試劑盒，（上海勁馬）。

大鼠促卵泡素（FSH）ELISA試劑盒，品牌：美國R&D。

大鼠抑制素B（INHB）ELISA檢測試劑盒，品牌：美國R&D。

大鼠抗苗勒氏管激素（AMH）ELISA檢測試劑盒，品牌：美國 DSL 。

1.2 給藥方法

參照《動物與人體的每公斤體重劑量折算系數表》《實驗動物學》及《中藥新藥藥效學研究》,中藥各組實驗當日冷開水配置所需動物灌胃濃度，低劑量，高劑量分別相當于臨床等效藥量的2、4倍。空白對照組，模型對照組和各中藥治療組每日灌胃2次，空白組和模型對照組每日灌胃蒸餾水，克齡蒙對照組采用相當于臨床等效藥量的4倍，每日灌胃1次，連續灌胃20 d。

表1 益腎調周法對大鼠血清E2，FSH的影響（±s,n=10）

表1 益腎調周法對大鼠血清E2，FSH的影響（±s,n=10）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與C組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01

組別 E2（pg/mL）FSH（mU/mL）A 27.42±5.62▲▲ 3.80±0.74▲▲■16.58±3.35**■■ 5.94±0.76**■■C 27.14±5.88▲▲ 4.78±1.01*▲D1 24.47±4.03▲ 4.65±0.67*▲D2 23.74±3.73*▲■ 4.79±1.33*▲E1 22.12±3.65*▲■ 4.94±1.02*▲B

1.2.1 一般情況的觀察 每日早上8點測體重1次,觀察一般生命體征、行為方式、進食狀況的改變、毛色及精神狀態的變化。

1.2.2 指標的檢測 于實驗末次給藥后，各組大鼠禁食24 h，不禁水，用電子天平稱重后，根據體重按隨機數字表法各組隨機抽取10只，斷頭采血2.0 mL，將所取血靜置30 min，3000 r/min，離心20 min，取血清。采用放射免疫計數儀測定血清中E2值；用酶聯免疫測定試劑盒，測定血清中FSH水平；采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附技術 ；檢測AMH，INHB測定各孔吸光度OD值，并通過酶標儀讀數讀出AMH、INHB 的濃度值。

1.2.3 卵巢早衰動物模型的建立

將分組動物連續陰道脫落細胞圖片兩個周期，有動情周期的大鼠納入組內，其余排除，并繪制組內每只大鼠的詳細動情周期表。模型復制依據文獻《化療所致卵巢早衰動物模型的建立》（付霞霏，何援利，2008年）記載：除空白對照組外，其余8組均使用環磷酰胺給予首次負荷劑量50 mg/kg后,以8 mg/（kg.d）的劑量連續腹腔注射14 d。空白對照組每天注射同容積生理鹽水，共15 d。造模完成后稱質量，并連續陰道脫落細胞涂片兩個性周期。陰道角化細胞持續出現7～8 d（75%），無規律的動情周期變化，提示卵巢早衰大鼠模型制作成功。造模成功者，納入組內繼續實驗，其余排除。

1.3 統計學分析

數據分析采用SPSS 18.0統計分析軟件處理，計量資料所有數據以“±s”表示。考察各個實驗組與空白組及模型組比較是否存在差異時使用Donnett-t檢驗；考察各個實驗組兩兩之間比較是否存在統計學意義時使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

表1的結果顯示，其他各組血清雌二醇水平與空白組比較，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），與空白組比較，模型組不僅存在統計學意義，并且差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，克齡蒙組，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，益腎調周法低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），而空白組，益腎調周法高劑量組的差異顯著（P＜0.01）；與克齡蒙組比較，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），而模型組的差異顯著（P＜0.01）。

表2的結果顯示，其他組血清FSH水平與空白組比較，克齡蒙組，滋腎低劑量組，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，益腎調周法低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），模型組的差異顯著（P＜0.01）；與模型組比較，滋腎低劑量，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，益腎調周法低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），而空白組，克齡蒙組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組的差異顯著（P＜0.01）；與克齡蒙組比較，空白組，益腎調周法高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），而模型組的差異顯著（P＜0.01）。

表2 益腎調周法對大鼠血清AMH,INHB的影響（±s,n=10）

表2 益腎調周法對大鼠血清AMH,INHB的影響（±s,n=10）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與C組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01

組別 AMH（pmol/L）INHB（ng/L）A 2.51±0.13▲▲ 16.51±2.49▲1.67±0.13**■■ 13.28±3.61**■■C 2.46±0.16▲▲ 16.16±4.61▲D1 2.07±0.19*▲■ 16.66±3.55▲D2 2.14±0.17*▲ 16.99±1.93▲E1 2.12±0.17*▲ 18.86±2.48*▲■E2 2.09±0.19*▲■ 16.59±2.51▲F1 2.39±0.20▲ 16.15±2.82▲F2 2.56±0.10▲▲ 20.43±2.05**▲▲■■B

表2的結果顯示，其他組血清AMH水平與空白組比較，滋腎低劑量組，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組的差異顯著（P＜0.01）；與模型組比較，滋腎低劑量，滋腎高劑量組，溫腎低劑量組，溫腎高劑量組，益腎調周法低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），而空白組，克齡夢組，益腎調周法高劑量組的差異顯著（P＜0.01）；與克齡蒙組比較，滋腎低劑量組，溫腎高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），而模型組的差異顯著（P＜0.01）。

表2的結果顯示，其他組血清INHB水平與空白組比較，溫腎低劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），模型組，益腎調周法高劑量組的差異顯著（P＜0.01）；與模型組比較，空白組，克齡蒙組，滋腎低劑量，滋腎高劑量組，溫腎高劑量組，而溫腎低劑量組，益腎調周法低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），益腎調周法高劑量組的差異顯著（P＜0.01）；與克齡蒙組比較，溫腎低劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），而模型組，益腎調周高劑量組的差異顯著（P＜0.01）。

3 討論

3.1 評價卵巢儲備能力的指標選擇

卵巢早衰的發病與免疫、遺傳、代謝及卵巢手術、放療、化療等諸多因素有關，而發病機制尚未明確，主要病理機制之一可能是卵巢儲備能力的下降[3]。卵巢儲備功能是指卵巢皮質區卵泡生長、發育，形成可受精的卵母細胞的能力。卵巢的衰老包括卵子和顆粒細胞的衰老，臨床上診斷POF時很難直接對卵巢內存留的卵子數和卵子質量進行檢測，因此通過與顆粒細胞生理功能相關的檢查來反映卵巢的衰老程度以預測POF。近年來，年齡、基礎雌二醇（E2）、基礎抑制素B（INHB）水平、基礎抗苗勒管激素（AMH）水平、FSH、FSH/LH、以及克羅米酚刺激實驗、Gn-RH 刺激實驗等相繼被提出[4]，但是，這些指標是否可以準確的預測卵巢的儲備能力，仍處于研究中。

FSH是女性卵巢功能調節的重要激素，必須與卵巢顆粒細胞上的受體結合后，才能夠激活顆粒細胞內的芳香化酶（P450arom），使雄激素芳香化并形成卵泡自身內的雌激素微環境[5]。INHB主要由卵巢顆粒細胞產生，是女性FSH分泌的重要調節因子，研究證明[6]，INHB的分泌量與基礎FSH呈負相關。當卵巢儲備功能出現減退時，血清INHB先于 FSH而產生變化，因此有學者認為血清 INHB水平降低是女性卵泡減少、卵巢老化的最早標志[7]。另外，INHB能夠特異作用于腦垂體細胞，通過旁分泌及自分泌方式發揮生物學效應，對促性腺激素釋放激素（GnRH）誘導的 FSH 分泌有選擇性的抑制作用，INHB可選擇性抑制 FSH的產生，并且可以通過調節E2底物來調節E2的產生，因此，另有學者認為INHB可作為卵巢儲備功能的直接指標,而垂體分泌FSH僅為間接指標[8]。由于INHB的變化是與E2同步,對FSH有負反饋作用, 所以認為INHB的變化啟動了圍絕經期女性生殖內分泌軸的一系列變化[9]。所以，可以考慮POF患者的生殖內分泌變化是否也符合這樣的變化。AMH由卵巢生長卵泡的顆粒細胞分泌, 因而血清 AMH水平亦可作為預測卵巢儲備功能的指標。La Marca等[10]認為AMH在整個月經周期呈相對穩定狀態，這意味著臨床上可以在月經周期的任一時期取血檢測 AMH水平，這也成為 AMH 作為卵巢儲備功能監測指標的優勢之一。研究發現卵泡液AMH水平和小竇狀卵泡雌二醇水平呈負相關關系,表明AMH生成和FSH活性之間存在著密切的相互依賴的調節關系[11]，AMH和AMH-R基因的一般多態性促使竇狀卵泡雌二醇生成并誘導卵泡生長加速，并且此種配體-受體復合體活性越低，FSH對卵泡發育和卵泡激素合成的作用越明顯[12]，因此，AMH可以調節卵巢對FSH敏感性[13]。因此本文選取了E2、FSH、AMH、INHB為評價指標，目的在于宏觀評價益腎調周法對卵巢儲備能力的影響。

3.2 療效機制探討

綜合實驗結果可知，對于激素水平的影響，益腎調周法高劑量組與克齡蒙治療組的結果相當，高于單純的滋腎添精方，溫腎添精方和益腎調周法低劑量組；而對于AMH和INHB的影響，調周法高劑量組明顯優于其他治療組。益腎調周法一方面可以提高血清中E2水平，通過性腺軸反饋抑制垂體FSH的分泌合成，而且可以通過升高血清中INHB的含量，抑制垂體分泌FSH，另外，通過提高血清中AMH的含量，提高卵巢對FSH的反應，從而促進優勢卵泡的生成，進而促進E2的分泌。總之，益腎調周法可以宏觀的調整血清中FSH、E2、AMH、INHB的含量，增強卵巢的敏感性并改善卵巢的儲備能力，其高劑量組的療效顯著。

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