尾加壓素及其受體在大鼠肺缺血-再灌注損傷中的表達

馬立民 饒旭光 段明科 楊偉 黎佩劍

[摘要] 目的 研究尾加壓素Ⅱ及其受體UT在大鼠肺缺血-再灌注損傷中的表達。 方法 采用免疫組織化學方法觀察UⅡ及其受體UT在缺血及再灌注不同時段大鼠肺組織中的變化，同時應用酶聯(lián)免疫吸附方法測定相應時段血漿中的UⅡ的濃度。 結(jié)果 UⅡ及UT在肺組織多種細胞中廣泛分布，缺血及再灌注后，UⅡ及UT在肺組織各種細胞中表達增強，相應血漿UⅡ的濃度變化與之一致。 結(jié)論 缺血及再灌注損傷可以促使肺組織中多種細胞合成、分泌、釋放UⅡ，同時上調(diào)UT的表達。

[關(guān)鍵詞] 尾加壓素；受體；缺血-再灌注損傷；肺

[中圖分類號] R-332???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2012）15-24-02

Expression of urotensinⅡand its receptors during ischemia-reperfusion injury in rats in vivo

MA?Limin1??RAO?Xuguang1??DUAN?Mingke2??YANG?Wei1??LI?Peijian3

1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the Second Affiliated Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515040,China;2.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the Second Hospital of Xiamen, Xiamen 361000,China; 3.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,People's Central Hospital of Huizhou, Huizhou 516000,China

[Abstract] Objective To investigate the expression of urotensinⅡand its receptors during ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Using IHC to observe the levels of UII and UT of rat pulmonary tissues and Using ELISA to observe the levels of UⅡ and UT of rat pulmonary tissues in different groups. Results UⅡ and UT was widely distributed in a variety of pulmonary cells.Its expression was boosted in pulmonary tissues and plasma after appearance of ischemia and reperfusion,especially in reperfusion stage,ischemia,reperfusion and up-regulation the expression of UT. Conclusion Ischemia and reperfusion can promote lung tissue cells to synthesize and excrete release UⅡ.

[Key words] UrotensinⅡ;Receptors;Ischemia-reperfusion injury;Lung

隨著細胞保護概念的提出，人們開始認識到，激發(fā)與扶植機體內(nèi)源性的抗損傷能力是細胞保護的最有效的措施。尾加壓素Ⅱ（UrotensinⅡ，UⅡ）作為一種人體新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，其病理生理意義尚不十分清楚。本研究采用動物實驗建立鼠肺缺血-再灌注損傷模型，觀察了內(nèi)源性UⅡ及其受體UT在肺缺血-再灌注損傷中的表達的變化。

1?資料與方法

1.1?一般資料

成年健康雄性SD大鼠24只，體重280～320 ｇ，由汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心提供（批號：S20091004）；主要試劑：UⅡ及UT多克隆抗體，生物素標記二抗，DAB顯色試劑盒及 SABC試劑盒（武漢博士德生物有限公司）、UⅡ酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（美國 Phoenix Pharmaceutical INC）。

1.2?模型制備

3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后每只大鼠肌肉注射阿托品0.4 mg（徐州萊恩藥業(yè)有限公司，

H32021060），氣管切開后氣管內(nèi)插管連接小動物呼吸機控制呼吸（TKR-200C型，江公司西特力麻醉呼吸機設備有限），呼吸頻率60次/min，吸呼比1∶1.5，工作壓力（即潮氣量）0.02 MP，吸氧濃度（FiO2）1.0。經(jīng)左胸第5肋間進入胸腔，游離左側(cè)肺門，由肺門下方繞過阻斷線，然后在線的末端套塑料膠管形成活結(jié)備阻斷用，阻斷前5 min每只大鼠由陰莖背靜脈注射肝素100 U/kg。30只大鼠隨機分為3組，每組10只：對照組（C組）：完成以上手術(shù)操作，但肺門不阻斷；單純?nèi)毖M（I組）：缺血1 h；缺血再灌注組（I/R組）：缺血1 h，再灌注2 h。試驗結(jié)束后在各時點用放血法處死動物。切取新鮮左肺門組織塊，用40 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化，滴加一抗后，按試劑盒說明常規(guī)SP法對切片標本進行染色，DAB顯色，蒸餾水洗、脫水、透明、封片。陽性染色為胞漿棕色顆粒。陰性對照以PBS代替一抗。

1.3?指標檢測

肺動脈血4 mL放入含10%EDTA-Na2和抑肽酶的試管中混勻，3 000 r/min離心10 min（5804R高速低溫離心機，德國eppendorf公司），分離血漿，注入EP管中，置-70℃冰箱保存待測。血漿UⅡ水平的測定均采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒ELIS A法，按試劑盒說明書進行。切片觀察及結(jié)果判定：UⅡ及受體UT的陽性細胞為胞漿內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。采用計算機圖像系統(tǒng)分析攝片，光鏡下每張切片各取5個視野（目鏡×40），分別計數(shù)各部位陽性細胞率（陽性細胞數(shù)/視野內(nèi)細胞總數(shù)×100%）。

1.4?統(tǒng)計學處理

用SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2?結(jié)果

2.1?大鼠肺組織中UⅡ及UT的變化

UⅡ及UT的變化主要表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞、支氣管上皮細胞、巨噬細胞和浸潤的中性粒細胞。表達水平變化見表1。

2.2?大鼠血漿中UⅡ的變化

正常情況下血漿內(nèi)有少量UⅡ存在，經(jīng)缺血以及再灌注損傷后，UⅡ的含量明顯升高，I組以及IR組與C組比較，UⅡ的含量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而再灌注損傷后其水平比單純?nèi)毖M亦有明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。UⅡ的表達水平變化見表1。

3?討論

目前肺移植已發(fā)展成為治療終末期肺疾病的有效手段之一，但與心﹑肝﹑腎等實質(zhì)器官比較，成功率較低。其中移植肺功能低下是影響肺移植療效的一個重要問題，而移植過程中缺血-再灌注損傷對肺的損害是重要原因[1]。肺缺血-再灌注損傷的機制是多方面的，國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合成酶活性的變化、氧自由基的產(chǎn)生、內(nèi)皮細胞激活、中性粒細胞浸潤、脂質(zhì)過氧化與炎性介質(zhì)的釋放是介導肺缺血-再灌注損傷的重要因素[2]。隨著細胞保護概念的提出，人們開始認識到，激發(fā)與扶植機體內(nèi)源性的抗損傷能力是細胞保護的最有效的措施。

UT是一種孤立的G蛋白藕聯(lián)受體即GPR14，原位雜交顯示GPR14在人類整個神經(jīng)系統(tǒng)都有表達，在外周主要表達于血管平滑肌、氣道平滑肌、血管內(nèi)皮、心肌等[3]。在慢性缺血、缺氧過程中和PTCD術(shù)后，血液中存在內(nèi)源性UⅡ含量的增加，肺血管也存在受體UT表達的變化，提示UⅡ?qū)Ψ闻K的病理生理有影響[4]。Gibosin A等[5]報道UⅡ能以劑量依賴性方式直接刺激一氧化氮合成酶（NOS）激活，增加血管組織一氧化氮的生成和組織cGMP的含量，引起平滑肌松弛，血管擴張。同時有研究[6]證實，一氧化氮能擴張肺血管，升高細胞內(nèi)cGMP，降低細胞內(nèi)鈣濃度，對肺缺血-再灌注損傷有保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，I組及IR組肺組織經(jīng)過缺血及再灌注后肺組織中UⅡ及UT的表達水平均明顯升高（P＜0.05），且再灌注后肺組織中UⅡ及UT的表達水平較單純?nèi)毖M亦明顯升高（P＜0.05）。而血漿中UⅡ水平的變化與之一致。結(jié)合相關(guān)文獻資料筆者推斷：生理情況下血漿及組織中UⅡ含量低，不作為循環(huán)激素發(fā)揮主要作用，也不起主要的自分泌和旁分泌作用。在肺組織缺血以及再灌注損傷的刺激下UⅡ以自分泌和旁分泌方式分泌增多，在局部組織及循環(huán)中發(fā)揮作用，同時其靶器官受體UT的表達也發(fā)生變化。UⅡ作為機體內(nèi)源性保護機制，激發(fā)抗損傷能力，減輕肺缺血-再灌注所致的細胞損傷。但需進一步實驗闡明UⅡ在肺缺血-再灌注損傷中的機制。

[參考文獻]

[1] Bittner HB，Binner C，Dahlberg P，et al.Reducing ischemia-reperfusion injury in clinical lung transplantation[J].Transplant Proc，2007，39（2）：489-492.

[2] Ovechkin AV，Lominadze D，Sedoris KC，et al.Lung ischemia-reperfusion injury:implications of oxidative stress and platelet-arteriolar wall interactions[J].Arch Physiol Biochem，2007，113（1）：1-12.

[3] Douglas SA，Ohlstein EH.Human urotensinⅡ，the most potentmammalian vasoconstrictor identified to date， as a therapeutic target for the management of cardiovascular disease[J].Trends Cardiovasc Med，2000，10：229-237.

[4] 賴榮德，梁子敬.尾加壓素Ⅱ受體拮抗劑對急性肺損傷大鼠血漿及肺泡灌洗液中尾加壓素Ⅱ的影響[J].中華急診醫(yī)學雜志，2006，15（11）：975-977.

[5] Gibosin A，Conyers S，Bern HA，et al.The influence ofurotensin Ⅱ on calcium flux in rat aorta[J]. J Pharmacol，1988，40：893-895.

[6] Esme H，F(xiàn)idan H，Solak O，et al.Beneficial effects of supplemental nitric oxide donor given during reperfusion period in reperfusion-induced lung injury[J].Thorac Cardiovasc Surg，2006，54（7）：477-483.

（收稿日期：2012-05-09）