絮凝劑產生菌絮凝活性分布及其發酵條件優化

劉清太，裴 璐，付 剛，王永澤，王金華

（1山東濰坊盛泰藥業有限公司，山東 濰坊262400；2湖北工業大學生物工程學院，湖北 武漢430068）

傳統的無機鹽絮凝劑和有機高分子絮凝劑（如氯化鋁、聚丙烯酰胺等）在完成污水處理處置工藝后很容易造成水質的二次污染，對人體都有毒害作用［1］.微生物絮凝劑是一類由微生物產生的可使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細胞以及膠體粒子等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產物［2］，主要包含糖蛋白、多糖、蛋白質、纖維素和DNA等［3］.它主要包括利用微生物細胞壁提取物的絮凝劑、利用微生物細胞代謝產物的絮凝劑和直接利用微生物細胞的絮凝劑.作為一種新興的絮凝劑，它具有安全、高效、可生物降解、不易造成二次污染等優點［4］，因此受到越來越多的關注和重視.目前，微生物絮凝劑的價格較高，主要是由于生產成本高和絮凝劑產率較低的原因.這是因為培養基的組成及培養條件影響微生物絮凝劑產生菌的生理代謝，從而影響微生物絮凝劑的產率.筆者分析絮凝活性的分布以及對培養條件進行優化，旨在提高微生物絮凝劑的產率，為后期的深入研究和實現規模化生產提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

芽孢桿菌（Bacill us sp.）EA，湖北工業大學生物工程學院研究室分離保藏.

種子培養基：葡萄糖，20 g／L；酵母膏，5 g／L；蛋白胨，10 g／L；氯化銨，2.5 g／L；磷酸二氫鉀，2 g／L；硫酸鎂，0.4 g／L；谷氨酸鈉，10 g／L.p H 7，115℃滅菌30 min.

發酵培養基：葡萄糖，40 g／L；谷氨酸鈉，30 g／L；酵母膏，8 g／L；磷酸氫二鉀，0.5 g／L；Mn SO4·H2O，0.1 g／L；Fe Cl3·6 H2O，0.05 g／L；MgSO4·7 H2O，0.5 g／L；CaCl2·2 H2O，0.15 g／L.p H 7，115℃滅菌30 min.

1.2 方法

1.2.1 種子培養液的制備 取1環斜面菌種于裝有30 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，于28℃、180 r／min培養13 h得到種子培養液.

1.2.2 發酵培養 按5%接種量將種子液接入發酵培養基（250 mL瓶裝50 mL）于37℃、200 r／min震蕩培養72h.

1.2.3 絮凝率測定方法 以絮凝率表示絮凝活性，測定方法為：100 mL燒杯中加人0.2 g高嶺土，加50 mL蒸餾水、2 mL質量分數為1%的Ca Cl2、1 mL發酵液，調p H至7.0.相同條件下不添加任何絮凝劑的水樣作為空白對照.采用磁力攪拌器，分兩段式攪拌：第一段為以120 r／min攪拌2 min；第二段為以80 r／min攪拌3 min，攪拌后靜止沉淀5 min.使用722型分光光度計在550 n m處測定上清液吸光度［5］.絮凝率計算公式如下：

絮凝率＝（A－B）／A×100%.式中：A為對照上清液550n m處的吸光度；B

為加樣上清液550n m處的吸光度.

1.2.4 絮凝活性的分布 對同樣體積的未接種培養液、菌株發酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細胞懸液分別進行絮凝活性測定.

2 結果與分析

2.1 絮凝活性的分布

按5%接種量將種子液接入發酵培養基（250 mL瓶裝50 mL）于37℃、200 r／min震蕩培養72h對菌株進行發酵培養.對未接種的培養液、菌株發酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細胞懸液進行絮凝活性測定，相對應的高嶺土懸濁液絮凝率分別為0%、71.7%、74.4%、11.3%.

未接種的培養液絮凝率為零，說明液體培養基中不含有絮凝成分物質.菌株發酵液和離心上清液的絮凝率都高達70%以上.含菌體發酵液比離心去菌體上清液絮凝率稍低，可能是菌體較輕，在發酵液中處于懸浮狀態，阻礙了光的通過［6］.可知EA菌產生的絮凝物質主要存在于發酵液中，是由微生物在發酵過程中產生并分泌到胞外.

2.2 培養基組成對菌株發酵產物絮凝活性的影響

2.2.1 不同碳源對產物絮凝特性的影響及最佳碳源含量的優化 按照發酵培養基的材料，不加碳源，配置好250 mL的無碳源發酵培養基.在培養基的其他成分不變的情況下，更換不同的碳源（各碳源的質量相同），在同樣的條件下考察菌株EA的發酵培養液的絮凝率，不同碳源的絮凝率分別為：甘油，61.3%；葡萄糖，73.2%；蔗糖，67.1%；淀粉，72.3%.可見采用葡萄糖和淀粉作為碳源時，產物絮凝率較高.在進行72 h發酵培養之后，以葡萄糖作為碳源的發酵液粘性最大，用此發酵液對高嶺土懸濁液進行絮凝時形成的絮體比其他樣品都大，而且在慢攪過程中絮體就已經沉降，原本渾濁的液體變得澄清.與此相比，其他幾種碳源雖也有較為明顯的絮凝作用，但形成的絮體較小，沉淀速度較慢.分別測量四種物質作為菌株EA碳源發酵72 h后菌細胞懸液的OD值，發現以葡萄糖和淀粉為碳源的明顯較大，說明EA菌在含這兩種葡萄糖和淀粉的培養基中的數量，明顯多于其他兩種碳源的培養基.這兩種碳源，既有利于菌株EA的生長，又利于絮凝劑的產生.葡萄糖的結構相對簡單，可以被直接吸收利用，有利于細胞的代謝和產物的合成，故選取葡萄糖作為發酵培養基的碳源.

2.2.2 不同氮源對產物絮凝特性的影響及最佳氮源含量的優化 按照發酵培養基的材料，不加氮源，配置好250 mL的無氮源發酵培養基，在培養基其他成分不變的情況下更換不同的氮源（各氮源的質量相同），考察發酵72 h后各個發酵液的絮凝率，其試驗結果如下：酵母膏，72.4%；硫酸銨，44.2%；蛋白胨，68.6%；氯化銨，48.5%.可以看出，各氮源對菌株EA所產絮凝劑的影響較大，且酵母膏和蛋白胨等有機氮源的絮凝率明顯高于硫酸銨和氯化銨.以酵母膏作為氮源所得到的發酵液絮凝率最高，故選取酵母膏作為發酵培養基的氮源.

2.3 培養條件對菌株發酵產物絮凝活性的影響

2.3.1 p H值的影響 用Na OH溶液分別調節培養基的初始p H 值，分別為至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0.測出不同p H值所對應的菌株發酵產物的絮凝率依次為33.2%、52.3%、69.5%、72.9%、75.2%和71.1%.可見菌株EA的最適初始p H值為7.5.培養基初始p H值過高或過低都不利于絮凝劑的產生，這是因為H＋和OH－能夠影響酶蛋白的氨基解離度和電荷情況，改變酶的結構和功能，引起酶活性的改變.而菌的代謝和絮凝劑的產生都是在酶的作用下發生的生化反應，p H值控制H＋和OH－濃度，從而影響菌的代謝和絮凝劑的產生［7］.

2.3.2 溫度的影響 調節恒溫震蕩培養箱的溫度，分別設定為28℃、32℃、37℃、40℃.在菌株發酵培養72 h后其產物絮凝率分別為49.3%、69.1%、74.6%和73.5%，說明菌株EA在37℃時產物的絮凝效果最好.溫度過低，細胞本身的聲場受到抑制，酶促反應速度緩慢，影響產物的生成.當溫度偏高時，絮凝率下降，因為絮凝劑本身成分是糖蛋白、多糖、蛋白質、DNA等，高溫可能導致變性，處理效果受到影響［8］.

2.3.3 不同接種量的影響 在發酵培養基中分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入種子液，經搖床培養72 h后，分別測定各組發酵液的絮凝活性，實驗結果如圖1所示.

圖1 接種量對絮凝率的影響

接種量為3%時，絮凝率較高，為75.4%；之后，隨著接種量的增大，絮凝率降低.由于接種量過大，培養液中細菌的初始濃度高，生長初期細菌生長繁殖則會消耗大量的營養物質；而接種量過小，培養液中細菌濃度低，使得培養周期延長.

2.3.4 正交設計實驗 在單因素實驗基礎上采用正交實驗方法對培養條件進行進一步優化.實驗采用L9（34）方法設計正交實驗，相對應的三個因素取為接種量、初始p H值和培養溫度，每個因素考察3個水平.正交實驗的因素水平見表1.

表1 正交試驗設計

表2 正交設計實驗結果

圖2 K與各因子之間的關系

表2中 K1、K2、K3分別表示第1、2、3列中水平對應的試驗結果之和.為了比較各因素對發酵產物絮凝活性的影響大小，選出各因素中對指標最有利的水平，以各因素的不同水平為橫坐標，以各因素對應的K的平均值為縱坐標，作因素和指標關系圖.從圖2中可以看出因素B（培養基初始p H值）的三個點高低相差較大，即極差R最大，因此對發酵產物絮凝活性的影響最顯著.其次是因素C，影響最小的是因素A，表中最佳培養條件是B3C2A2，即初始p H為7.5，培養溫度為37℃，種子液接種量為4%.選取B2C2A1為培養條件，即選擇單因子實驗時各因素中最優條件進行發酵培養，測其絮凝率為76.6%，小于78.5%.故最佳培養條件為B3C2A2.

3 結論與展望

通過對未接種的培養液、菌株發酵液（含菌體）、離心去菌體上清液和菌細胞懸液進行絮凝活性測定，得出發揮絮凝作用的物質是EA菌的發酵產物，是由微生物在發酵過程中產生并分泌到胞外.通過單因子實驗得到最佳碳源是葡萄糖，在以葡萄糖作為碳源時，EA菌的生長旺盛，絮凝率最高.在發酵培養基中有機氮源的效果較好，以酵母膏作為氮源時，絮凝效果最好.通過培養條件單因子實驗和正交實驗得到的最佳培養條件為：菌株EA發酵培養的最適初始p H7.5，最適培養溫度為37℃，最適宜接種量為4%.菌株發酵液的絮凝率也從初始的71.7%提高到78.5%.

在實驗室研究階段培養成本很高，而尋找廉價的秸稈、纖維素等有機物質含量豐富的廢水等作為培養底物是推動微生物絮凝劑工業化進程的重要途徑.其次，利用分子生物學技術加強絮凝劑產生菌的絮凝基因研究，把控制絮凝劑生成的基因導入到特定的微生物細胞內表達，可以省去篩選的過程并很可能大大提高絮凝劑產率.再次，利用菌株間的相互作用，將絮凝菌同其他污水處理的菌株進行復配，可以拓寬絮凝劑的使用范圍，對多種污水進行處理處置.最后，生物化學聯合絮凝劑能很大程度上提高絮凝劑的使用效率和處理效果，也將是今后微生物絮凝劑領域一個新的研究方向.

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