鹽酸戊乙奎醚對膿毒血癥大鼠外周血內皮細胞及其微粒計數的影響

劉 筍 艾宇航 覃雙全

1.中南大學湘雅醫院重癥醫學科，湖南長沙 410008；2.湖南省常德市第一人民醫院急診科，湖南常德 415000

膿毒血癥及序貫發生的多臟器功能障礙是重癥監護室患者死亡的主要原因。近年來的研究表明，參與膿毒血癥的細胞中，血管內皮細胞（CECs）非常關鍵。膿毒血癥時的CECs在形態、壽命和功能方面都發生改變。膿毒血癥時CECs及微粒（EMPs）數量升高，且其數量變化與病情的嚴重程度及預后相關。鹽酸戊乙奎醚是我國具有獨立知識產權的新一代高選擇性抗膽堿藥物，具有很強的抗膽堿作用，作用全面，持續時間長，大量研究顯示在缺血再灌注損傷和圍術期器官功能保護上發揮重要作用。本研究從對內皮細胞的影響進一步探討其保護作用，為臨床應用提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性 SD 大鼠 120 只，體重（200±70）g，術前禁食 8 h，禁飲4 h。

1.2 試劑

IL-6、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程研究所）；基質顯色鱟試劑盒（廈門鱟試劑實驗廠有限公司）；FcRblocking試劑（Miltenyi公司，德國）；Histopaque-1077（Sigma 公司，美國）；PE標記的抗人 CD146單克隆抗體，PE標記的抗人CD146單克隆抗體（BD公司，美國）。

1.3 實驗分組及處理

隨機將其分為六組：①生理鹽水對照組（sham組）：假手術+生理鹽水 2 mL；②CLP組：CLP+生理鹽水 2 mL；③PHC0.1組：CLP+PHC0.1mg/kg；④PHC0.5組：CLP+PHC0.5mg/kg；⑤PHC1.0組 ：CLP+PHC 1 mg/kg；⑥PHC2.0組：CLP+PHC 2 mg/kg。

1.4 膿毒血癥動物模型制備

大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，鈍性分離右側頸外靜脈，置管備輸液使用。盲腸結扎穿孔CLP模型[1]，即沿腹部正中切開2 cm腹壁，暴露盲腸，距回盲瓣遠端結扎盲腸，結扎長度為10 mm，然后用18口徑穿刺針單次穿刺被結扎盲腸，由穿刺孔擠出糞便進入腹腔，后將盲腸送回原位，雙層縫合腹壁。假手術組只切開腹壁再雙層縫合，盲腸不作結扎穿孔。CLP手術在10 min內完成。所有操作結束后大鼠保溫靜置3 h。3 h后，PHC0.1組、PHC0.5組、PHC1.0組、PHC2.0組分別經右頸外靜脈輸注 0.1、0.5、1.0、2.0 mg/kg（均用生理鹽水稀釋至2 mL）；CLP組及生理鹽水對照組均輸注生理鹽水2 mL。實驗過程中大鼠直腸溫度維持（37.0±0.5）℃。

1.5 標本采集及處理

各組隨機各取20只觀察CLP或者假手術術后6、12、24、48、72 h存活率。各組余下均在行生理鹽水或者鹽酸戊乙奎醚處理后3 h頸外靜脈采血2 mL離心分離血漿和血細胞，血細胞用于檢測CECs，血漿用于檢測TNF-α、IL-6和LPS，另取1 mL血液高速離心后，分離血漿，用于EMPs的檢測。

1.6 觀察指標

ELISA法檢測血漿TNF-α、IL-6，鱟試劑基質終點顯色法測定血漿LPS含量；流式細胞學檢測CECs和EMPs，嚴格按各試劑盒說明書操作。

1.7 統計學方法

使用SPSS 13.0統計軟件，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組生存率比較

各個時間點CPL組均較sham組生存率低，而使用鹽酸戊乙奎醚各組間及與CPL組比較，生存率差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表1。

2.2 血漿TNF-α、IL-6和LPS含量，外周血CECs和EMPs計數

各項指標CPL組全部高于sham組；TNF-α、IL-6水平和外周血CECs和EMPs計數：使用長托寧各組均低于CPL組，長托寧1.0 mg/kg和2.0 mg/kg（兩劑量組比較差異無統計學意義）低于0.1 mg/kg和0.5 mg/kg（兩劑量比較差異無統計學意義）；sham組LPS含量低于所有其他組（P＜0.05），而其他各組間LPS含量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表1 大鼠72 h生存率[n（%），n=20]

表2 血漿TNF-α、IL-6、內毒素含量和外周血內皮細胞及其微粒計數（±s，n=10）

表2 血漿TNF-α、IL-6、內毒素含量和外周血內皮細胞及其微粒計數（±s，n=10）

注：與 CPL 組比較，*P ＜ 0.05；與 PHC0.1組比較，﹟P ＜ 0.05；與 PHC0.5組比較，▼P＜0.05

組別 TNF-α（ng/L）IL-6（ng/L）LPS（ng/L）CECs（/105PBMCs）EMPs（個/mL）sham組CPL組PHC0.1組PHC0.5組PHC1.0組PHC2.0組68±30 291±127 255±120*260±102*156±95*﹟▼129±116*﹟▼34±18 181±102 167±103*170±98*104±73*﹟▼78±75*﹟▼84±37 280±71 267±83*290±64 300±39 258±77 0.84±0.47 48.02±11.07 37.12±13.36*29.70±14.52*20.92±9.08*﹟▼18.83±10.19*﹟▼24±17 278±95 167±93*190±40*103±59*﹟▼108±78*﹟▼

3 討論

膿毒血癥是宿主對感染的一種全身性反應，也是一種死亡率極高的疾病階段。膿毒血癥時全身內皮細胞（VECs）被激活，對整個機體而言，內皮細胞功能障礙表現為止血系統失衡、細胞黏附增加[2]、白細胞募集、血管舒縮功能改變和喪失屏障作用。CECs及EMPs作為膿毒血癥中VECs功能障礙是重要的細胞標志物。

鹽酸戊乙奎醚是新型選擇性抗膽堿藥物，對中樞和周圍神經均具有很強的抗膽堿作用，作用全面，持續時間長，高度選擇性M1、M3受體拮抗作用，而對M2受體無明顯作用，大量研究顯示在缺血再灌注損傷和細胞功能保護上發揮作用，在圍術期器官功能保護方面研究較多；改善微循環，拮抗炎癥因子及炎癥介質，保護細胞膜及溶酶體膜，降低毛細血管通透性等，并在減輕局部炎癥反應，緩解心肌細胞氧化應激反應方面發揮作用。

本實驗表明，鹽酸戊乙奎醚能夠有效減輕外周血CECs和EMPs計數。膿毒血癥時機體促、抗炎介質產生及釋放失衡，早期以促炎介質的釋放為主，包括TNF-α、IL-1、IL-6和ICAM-1等[3]。大量的實驗研究一致認為[4]，TNF-α是膿毒血癥發病的重要介質，是膿毒性休克時最早釋放且起關鍵作用的介質，它啟動膿毒血癥的炎性反應，并在發展過程中起放大作用，即所謂的免疫炎癥的 “瀑布反應”。膿毒血癥時，TNF-α和干擾素可誘導整聯蛋白α導致內皮細胞脫落[5]。同時，內皮細胞合成分泌的白細胞趨化因子及表達的黏附因子增加，促進白細胞與內皮細胞黏附，而中性粒細胞可通過釋放蛋白酶來降解黏連蛋白促進內皮細胞脫落[6]。本實驗使用PHC后血漿TNF-α、IL-6和LPS水平均降低，由此筆者認為PHC通過抑制TNF-α等炎癥因子釋放，從而減少外周血CECs及EMPs計數，使內皮細胞受到保護。具體機制需要進一步研究。

[1]LV R，Zhou Wj，Chu C，et al.Mechanism of the effect of hydroxyethyl starch on reducing pulmonary capillary permeability in a rat model of sepsis[J].Ann Clin Lab Sci，2005，35（2）：174-183.

[2]Rignault S，Haefliger JA，Gasser D，et al.Sepsis up-regulates the expression of connexin 40 in rat aortic endothelium [J].Crit Care Med，2005，33（6）：1302-1310.

[3]Yao YM，Redl H，Bahrami S，et al.The inflammatory basis of trauma/shock-associated multiple organ failure[J].Inflamm Res，1998，47（5）：201-210.

[4]王今達.膿毒癥：感染性休克MODS的預防[J].中國危重病急救醫學，1999，11（8）：453-455.

[5]Boehme MW，Galle P，Stremmel W.Kinetics of thrombomodulin release and endothelial cell injury by neutrophil-derived proteases and oxygen radicals[J].Immunology，2002，107（3）：340-349.

[6]Ruegg C，Dormond O，Foletti A.Suppression of tumor angiogenesis through the inhibition of integrin function and signaling in endothelial cells：which side to target?[J].Endotheliam，2002，9（3）：151-160.