NDRG4基因甲基化檢測在結直腸癌早期診斷中的應用研究

趙慧霞 李秋文 董偉偉 段昕妤 朱建華 王如良 郝怡鑫 葉 明 肖文華

解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，北京 100048

NDRG4（N-myc downstream-regulated gene 4）為抑癌基因NDRG基因家族成員[1]，該基因家族在人體多種其他正常組織中高表達，在某些腫瘤組織中不表達或低表達，低表達則可能與啟動子高甲基化相關。大腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床最常見的惡性腫瘤之一[2-3]，在我國其發(fā)病率呈上升態(tài)勢，且晚期患者預后很差，5年總體生存率不到 15%，然而有關NDRG4基因與啟動子甲基化狀態(tài)在結直腸癌中的作用尚未得到闡明[4]。DNA甲基化常常是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件，因此，特異基因的甲基化可作為腫瘤早期診斷的分子標志物。近年來研究認為NDRG4基因存在于CRC腫瘤組織和體液中，且可能具有穩(wěn)定性高、可重生性，這為提高CRC的早期篩查[5-6]、早期診斷提供了一個全新的視角。本研究采用巢式甲基化特異性PCR（nested methylation specific PCR，nMSP）檢測結直腸癌血、尿、糞便NDRG4基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。比較結直腸癌組織與糞便、尿、血中的NDRG4甲基化在早期診斷中的敏感性和特異性及其與結直腸癌臨床病理特征之間的關系，以探討其在結直腸癌早期診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集

取我院普外科2010年6月～2011年8月手術切除的84例患者的結直腸癌、癌旁組織，均經(jīng)病理證實；年齡為36～81歲，平均年齡53歲。并同期選擇相匹配的正常對照者30例（腹股溝疝患者和下肢靜脈曲張患者）。全部受檢者空腹抽血2 mL，EDTA-2Na 抗凝；同時留取晨尿 50～100 mL，糞便 100～200 mg，血、尿液、糞便標本于手術前收集，收集后30 min內送實驗室。血、尿液、糞便立即提取基因組DNA，置于-20℃凍存?zhèn)溆谩４竽c癌患者術后立即取材，癌組織、癌旁組織標本，分裝并-80℃保存。所有患者在術前均未接受過化療、放療及免疫治療，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器

組織DNA提取試劑盒：組織基因組DNA提取試劑盒（天根公司）；糞便DNA提取試劑盒：stool DNA Extraction Kit（Bioneer公司）；血DNA提取試劑盒：天根全血基因組DNA提取試劑盒、血漿游離DNA純化試劑盒（天根公司）；尿液DNA提取試劑盒：尿液基因組DNA快速提取試劑盒；亞硫酸鹽處理試劑 ：Wizard DNA Clean-up system、EZ DNA Methylation TM-Direct Kit（Promega 公司）；X-SssⅠ內 切酶（英國NEB公司）；對亞硫酸氫鹽轉化的DNA進行全基因組擴增試劑盒：EpiTect Whole Bisulfitome Kit（德國Qiagen公司）；PCR 擴增試劑：HotstarTaq DNA polymerase（德國 Qiagen公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

1.2.1.1 組織DNA的提取 先將組織在液氮中研碎，再加入DNA提取緩沖液和蛋白酶K，于37℃消化直至液體變得清亮，然后參照說明書用飽和苯酚/氯仿溶液常規(guī)提取DNA。最后用紫外分光光度儀檢測純度及含量。

1.2.1.2 血漿、尿液、糞便DNA的提取 操作步驟按說明書進行。DNA抽提后用紫外分光光度儀檢測純度及含量。

1.2.1.3 全血DNA的提取 用天根生化的全血基因組DNA提取試劑盒提取正常人外周血樣本中基因組DNA，操作步驟按說明書進行。提取DNA后用SssⅠ處理的正常人淋巴細胞基因組作為陽性對照，未經(jīng)處理的淋巴細胞基因組作為陰性對照。

1.2.2 基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾

組織基因組DNA參照Wizard DNA Clean-up system試劑盒進行修飾；血、尿、糞便基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾：參照EZ DNA Methylation TM-Direct Kit試劑盒說明書進行。

1.2.3 MDA對亞硫酸氫鹽轉化的DNA進行全基因組擴增

使用EpiTect Whole Bisulfitome Kit擴增試劑盒進行全基因組擴增，即取5 μL亞硫酸氫鈉修飾的DNA，加入5 μL滅菌水，再加入在冰上配制的1 μL REPLI-g Midi DNA polymerase和 29 μL EpiTect WBA Reaction Buffer反應混合液，振蕩混勻，在28℃等溫全基因組擴增反應8 h，然后95℃5 min終止反應，4℃保存。

1.2.4 巢式甲基化特異性PCR和電泳分析

NDRG4引物設計參考文獻[7]；引物序列、退火溫度和擴增產(chǎn)物長度（表1）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。 PCR 體系包含 10 × Buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0．2 μL，dNTP 2 μL，一對外側上下游引物各1 μL，MDA擴增的基因組DNA 2 μL，Mg2+0.5 μL，滅菌用水 15.8 μL。 同時設立陽性對照、陰性對照和空白對照。外側PCR循環(huán)參數(shù)：95℃15 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，以上步驟共 25 個循環(huán)，72℃延伸7 min。第二輪PCR使用兩對內側引物分別擴增，25 μL PCR 體系：10 × Buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶 0.2 μL，dNTP 2 μL，甲基化和未甲基化上、下游引物各 1 μL，外側 PCR的擴增產(chǎn)物 2 μL 為模板，Mg2+0.5 μL，滅菌用水 15.8 μL。內側PCR 循環(huán)參數(shù)：95℃ 15 min，95℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 30 s，以上步驟共35個循環(huán)，72℃延伸7 min。經(jīng)上述兩次PCR擴增后，將5 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。

表1 NDRG4基因的巢式甲基化特異性PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌和癌旁組織NDRG4基因甲基化變化

在84例結直腸癌組織中，NDRG4基因甲基化發(fā)生率81.0%（68/84），而癌旁組織為 8.3%（7/84）；用于結直腸癌的組織學診斷的敏感性為81.0%（68/84），特異性則為91.7%（77/84）。

表2 NDRG4甲基化與結直腸癌臨床特征的關系

2.2 結直腸癌組織和糞便中NDRG4甲基化與臨床病理特征的關系

NDRG4甲基化與年齡、分化程度及TNM分期均無關，而與腫瘤的淋巴結轉移有關，即有淋巴結轉移的腫瘤組織和無淋巴結轉移的腫瘤組織糞便中的NDRG4表達差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。 見表2。

2.3 結直腸癌組織、糞便、尿、血中NDRG4基因甲基化比較

NDRG4基因甲基化檢測的敏感度、特異度分別為：血54.8%和 78.1%；尿 72.6%和85.0%；便 76.2%和 89.1%；組織81.0%和91.7%。在本研究分析的3個微量DNA標本中，糞便和尿液基因甲基化診斷CRC的敏感度較高，特異性也較高，而血的特異性和敏感度較低（圖1）。因此基因甲基化檢測用于臨床時，需要聯(lián)合檢測尿、便基因，以保證診斷敏感度及特異度均達到較高水平。

圖1 nMSP檢測結直腸癌組織和糞便、尿、血NDRG4基因甲基化

3 討論

DNA序列測定表明，NDRG4基因長32 kb，由17個外顯子及16個內含子組成[8]。既往研究已證實NDRG4在成年人心、腦中表達明顯高于胎兒，提示NDRG4與心、腦發(fā)育有關。雖然在腫瘤中的作用還不清楚，但大量研究表明該基因與腫瘤細胞的生長、分化和轉移可能有一定關系。其基因5′端調控區(qū)域含有CpG島，在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中常常被甲基化，NDRG4基因甲基化被認為是結直腸癌的重要生物學特征。Veerle等[7]最近發(fā)現(xiàn)NDRG4是候選腫瘤抑制基因和直腸癌的潛在生物標志物，NDRG4啟動子的甲基化可作為生物標志物，用于糞便樣品檢測直腸癌，敏感性為61%，特異度為93%。本實驗利用巢式甲基化特異性PCR（nMSP）檢測NDRG4甲基化狀態(tài)，在84例結直腸癌組織中，NDRG4基因甲基化發(fā)生率81.0%（68/84），而癌旁組織為8.3%（7/84）；診斷的敏感性為81.0%，特異性則為91.7%。在本研究分析的糞便、尿、血3個微量DNA標本中，糞便和尿液基因甲基化診斷CRC的敏感度、特異性較高；而血的特異性和敏感度較低。

雖然腫瘤細胞可以釋放許多游離DNA到外周血、尿液中，但與腫瘤組織樣品相比，外周血血清樣品中DNA的量仍然是較低的（ng級），加之在用NaHSO3，修飾的過程中大部分DNA將被降解，因此，對于微量DNA樣品，普通MSP法的靈敏度仍需進一步提高。本實驗采用的MDA技術檢測NDRG4甲基化狀態(tài)，具有擴增效率高，保真性能好的優(yōu)勢，是一種新興的全基因組擴增技術，適合低含量腫瘤樣本甲基化狀態(tài)檢測。

對NDRG4基因啟動子區(qū)甲基化水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)該檢測CpG位點腫瘤樣本組織和對應的癌旁樣本組織甲基化率分別為81.0%和8.3%，由于所取癌旁樣本不是正常結直腸粘膜組織，發(fā)生一定程度甲基化，提示甲基化作用可能與結直腸癌發(fā)生密切相關。同時發(fā)現(xiàn)該檢測CpG位點的甲基化率在年齡、分化程度及TNM分期差異均無顯著性，說明甲基化與結直腸癌的發(fā)展過程中并非起主要作用，可能只在結直腸癌的發(fā)生早期發(fā)揮作用。

本實驗利用巢式甲基化特異性PCR（nMSP）檢測NDRG4甲基化狀態(tài)，結直腸癌糞便中的甲基化的敏感度為76.2%，特異度為89.1%；尿液敏感度72.6%，特異度85.0%，這說明糞便和尿液中的NDRG4甲基化有極大可能被作為早期檢測結直腸癌的非侵入性生物標志物。且NDRG4無論來源于尿液還是糞便樣本，均易于采集，穩(wěn)定性強，不易被降解，重復性及特異性高，使得其有很大可能成為臨床診斷的敏感指標。因此，本研究結果有望能夠豐富結直腸癌的發(fā)病機制并為將來臨床上將NDRG4甲基化在結直腸癌中作為一個新的診斷靶點提供一定理論基礎。

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