紅細胞貯存時間對脂多糖誘導的中性粒細胞炎癥釋放的影響

張莎娜 王海平 曹 惠 王全立

1.解放軍總醫院輸血科，北京 100853；2.軍事醫學科學院附屬醫院輸血科，北京 100071

血液及血液成分在儲存過程中會發生損傷，紅細胞自身的生化功能及形態也會發生改變。紅細胞懸液中的白細胞和血小板會自發的釋放許多生物活性物質，多數活性分子會隨著貯存時間的延長而濃度升高。白細胞易崩解并釋放各種細胞因子（白介素等）。已有臨床報道，血液的貯存損傷會對心臟手術患者和創傷患者帶來不良的臨床效應[1]，但由于發生原因復雜、臨床表現不明確，目前相關的臨床報道仍存在爭議。細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要因素[2]。中性粒細胞（polymorphonuclear，PMN）是機體內重要的炎癥反應細胞[3]，為數量最多的白細胞。細菌LPS可以刺激PMN產生多種炎癥介質，但對其確切的內在機制了解甚少，為了解大量庫存紅細胞的輸注對受者輸血免疫功能的影響，本研究采用體外實驗的方法，在LPS的誘導下，觀察隨紅細胞保存時間的延長，對受者PMN炎癥釋放的作用。現總結報道如下：1材料與方法

1.1 試劑

LPS購自Sigma公司（試劑批號：L2880），中性粒細胞分離液購自天津市川頁生化制品有限公司，IL-6和TNF-α試劑盒均購自北京欣博盛生物科技有限公司。

1.2 懸浮紅細胞上清的制備

將制備好的懸浮紅細胞于4℃保存，分別于1、21、35 d（D1、D21、D35）無菌條件下取出 30 mL，1 500 r/min 離心 20 min得到上清，再將上清12 500 r/min離心5 min，去除細胞后分裝于-20℃凍存待集中測定。

1.3 全血中性粒細胞的分離、培養及分組

取9份健康獻血者的全血，3 500 r/min離心15 min，得到富含白細胞的層面35～40 mL，分2～3次緩慢地等量加入到15 mL中性粒細胞分離液上，2 000 r/min離心25 min，吸取富含白細胞的中間層，再加入5倍體積以上的PBS，1 200 r/min離心10 min去除血小板；加入含 NH4Cl、NaHCO3溶血素2mL，37℃溶血 30min，溶解殘存的紅細胞；再加入少量的PBS，1 500 r/min離心10 min，去上清，余下的則為中性粒細胞；PBS洗滌2次，加入RPMI-1640培養液懸浮細胞。經Wright-Giemsa染色鑒定其純度＞95%[4]，然后進行臺盼蘭排斥法證實其存活率＞98%。將細胞懸液濃度調整到2×106/mL，將紅細胞懸液分為60份，分別進行測定。

24孔細胞培養板中每孔加入1.5 mL細胞懸液，細胞完全培養基由RPMI-1640、10%小牛血清、1%青鏈霉素組成（購自上海微科生化試劑有限公司）。本實驗分為對照組和實驗組，均各設一個空白對照，不加紅細胞上清，只加完全培養基，其余分別加入含20%D1、D21、D35的紅細胞上清的細胞完全培養基。對照組（30份）：未加LPS組，培養24 h后收集細胞培養上清；實驗組（30 份）：先培養 12 h 加入 1.5 μL、100 μg/mL的LPS，再培養12 h收集細胞培養上清。將細胞培養板置于CO2細胞培養箱（37℃、濕度100%、體積分數5%CO2）中孵育。

1.4 細胞因子檢測

收集細胞培養上清，12 500 r/min離心5 min，去除細胞，細胞培養上清中IL-6及TNF-α濃度采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測，按產品使用說明書進行。

1.5 統計學方法

采用SAS 9.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗；以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅細胞上清細胞因子的表達情況

在各時間點收集的未加PMN的紅細胞上清中，均未檢測到IL-6和TNF-α。

2.2 兩組紅細胞上清中IL-6水平比較

在LPS的誘導下，D35、D21紅細胞上清中IL-6水平高于D1紅細胞上清（P＜0.05），其濃度隨紅細胞上清保存時間的延長而增加。與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。對照組D1、D21、D35紅細胞上清中的IL-6水平高于空白對照，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組，D1、D21、D35的 IL-6水平分別比空白對照增長（1.32±0.05）、（1.65±0.08）、（2.14±0.13）倍。 D1、D21、D35 之間差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗組D1、D21、D35紅細胞上清中IL-6水平與對照比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組紅細胞上清中IL-6水平比較（±s，ng/L）

表1 兩組紅細胞上清中IL-6水平比較（±s，ng/L）

組別 例數 空白對照 D1 D21 D35對照組實驗組30 30 t值 P值83.04±35.61 384.73±45.82 28.48＜0.05 192.62±80.98 500.88±99.85 13.13＜0.05 275.84±80.26 634.45±99.71 23.90＜0.05 356.77±80.28 825.46±95.57 20.57＜0.05

2.3 兩組紅細胞上清中TNF-α水平比較

LPS誘導下，D35、D21的紅細胞上清中TNF-α水平高于D1紅細胞上清，但差異無統計學意義（P＞0.05）。實驗組D1、D21、D35紅細胞上清中TNF-α水平與對照比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

目前全世界都面臨血液資源日益緊張的境況，對于延長血液保存時間、提高血液保存質量的需求更為迫切。輸血相關的免疫變化可能是紅細胞、白細胞、血小板等儲存過程中所產生的可溶性物質所引起的。LPS是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，是強有力的免疫炎癥系統活化因子，可引起機體炎癥反應，導致致死性感染性休克，病死率極高。本文參照文獻[5]，按照LPS的劑量效應關系結果，選擇LPS的終濃度為 100 μg/mL。 參照輸血體外實驗“雙重打擊”（two-hit）的模型[6]，采用LPS誘導，模擬臨床嚴重創傷后患者的炎癥反應。嚴重創傷患者在其救治過程中需要大量輸血，這對患者的免疫功能影響很大。因此，培養PMN過程中加入20%上清，相當于50 kg體重的臨床患者輸注12～15U的懸浮紅細胞。現有研究表明，輸血相關的免疫反應可能與血液保存過程中產生的細胞因子有關。炎癥細胞因子（IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α）主要由外周的免疫細胞（包括中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞）產生，通常介入免疫及炎癥反應[7]，TNF-α能刺激巨噬細胞產生IL-1間接刺激體溫中樞。本實驗所檢測的細胞因子均為參與炎癥反應的重要的介質。TNF-α可促進炎癥反應，引起白細胞與毛細血管內皮細胞的黏附，黏附的中性粒細胞被激活可促發損傷級聯反應，導致水腫、炎癥反應和缺血缺氧的惡性循環[8]。IL-6是炎癥和急性期反應重要的細胞因子，其升高的水平與多器官功能衰竭風險增高有關。同時，IL-6和TNF-α共同作用上調免疫應答，是促進炎癥反應、引起敗血癥的重要介質[9]。這兩個細胞因子的變化可以間接解釋輸血引起的炎癥反應。

表2 兩組紅細胞上清中TNF-α水平比較（±s，μmol/L）

表2 兩組紅細胞上清中TNF-α水平比較（±s，μmol/L）

組別 例數 空白對照 D1 D21 D35對照組實驗組t值P值30 30 77.59±7.61 79.45±9.82 0.83＞0.05 84.10±9.85 86.34±10.46 0.85＞0.05 87.66±10.44 89.78±11.71 0.74＞0.05 93.77±11.28 95.46±12.57 0.54＞0.05

本實驗結果顯示，在LPS的誘導下，D35較D1紅細胞上清促使PMN釋放更多的TNF-α和IL-6，可以解釋為庫存血的輸注增強了PMN的炎癥反應，這與Baumgartner等[5]的實驗結果相類似。臨床救治時，同時大量輸注的血液保存時間并不相同，這可能是造成救助效果不明顯的原因之一，這種臨床效應很多時候被臨床醫生忽視，或歸因于疾病的并發癥。提示在未來的實驗中還應進行相關的基礎支持研究，努力明確輸血相關的副作用，提高臨床輸血安全。

[1]Silliman CC，Boshkov LK，Mehdizadehkashi Z，et al.Transfusion-related acute lung injury：epidemiology and a prospective analysis of etiologic factor[J].Blood，2003，101（2）：454-462.

[2]Motzkus D，Schulz MS，Heitland A.The novel beta defensin DEFB 123 prevents lipopolysaccharide mediated effects in vitro and vivo[J].FASEB J，2006，20（10）：1701.

[3]Sarah F，Andrew E，Leitch，et al.Neutrophil Apoptosis：Relevance to the Innate Immune Response and Inflammatory Disease [J].Innate Immun，2010，2（1）：216-227.

[4]Mesri M，Altieri DC.Endothelial cell activation by leukocyte microparticles[J].Immunol，1998，161（2）：4328-4337.

[5]Bumgartner JM，Nydam TL，Clarke JH，et al.Red Blood Cell Supernatant Potentiates LPS-Induced Proinflammatory Cytokine Response From Peripheral Blood Mononuclear Cells [J].Journal of Interferon&Cytokine Research，2009，29（6）：333-338.

[6]Vlaar APJ，Hofstra JJ，Levi M，et al.Supernatant of aged erythrocytes causes lung inflammation and coagulopathy in a “Two-Hit” in vivo syngeneic transfusion model[J].Anesthesiology，2010，113（1）：92-103.

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