多孔細菌纖維素-聚乳酸乙醇酸-羥基磷灰石復合支架的制備及性能研究

姚志文 王紅忠 蔡 琛 楊 安 劉 唯 李紅玖 程由勇 李春華 陳治清

1.廣州醫學院附屬深圳沙井醫院口腔科，廣東深圳 518104；2.四川大學華西口腔醫學院口腔材料教研室，四川成都 610041

組織工程支架材料應用時，單一的材料往往難以同時滿足生物體對其力學強度、親水性、易成型性和生物相容性等多方面的要求，為了盡量同時滿足這些要求，人們往往通過幾種生物材料的組合來達到預期目的。基于這個思路，本課題選用細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）、聚乳酸乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）和羥基磷灰石（HA）通過溶劑澆鑄/粒子浸出法制備多孔BC-PLGA-HA復合支架，分析其相關理化性能，通過體外MG-63細胞培養，初步評價其體外生物相容性及在組織工程中的應用可行性。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱（躍進醫療器械廠，上海），CO2培養箱（Sanyo，日本），LDZ5-2臺式離心機（北京醫用離心機廠），YJ-1450型超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司，江蘇），倒置相差顯微照相系統（Olympus，日本），JSM-6360LV電子顯微鏡（EJOL，日本），HTS7000 plus多孔板紫外/熒光/可見光高效分析儀（PE，美國）。

1.2 主要試劑

高糖 DMEM 培養基（Gibco，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰蛋白酶（Gibco，美國），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（Sigma，美國），二甲基亞砜（Sigma，美國），乙二胺四乙酸（Sigma，美國），Braford蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司），成骨樣細胞MG-63（四川大學口腔疾病國家重點實驗室）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 多孔BC-PLGA-HA復合支架的制備

取1.0 g的PLGA和5 mL氯仿配成溶液，加入經過目篩的粒徑為 100～200 μm 的 NaCl晶體 1.0 g和 HA 0.3 g，磁力攪拌和超聲振動使其均勻分散。室溫下將以上配好的PLGA溶液倒入底層鋪有BC膜的玻璃皿中。靜置24 h，干燥后PBS液反復漂洗，冷凍干燥后裁剪成直徑5 mm圓片。25 kGy60Co照射24 h消毒滅菌。4℃保存備用。

2.1.2 多孔BC-PLGA-HA復合支架相關理化性能分析

2.1.2.1 表面形貌觀察 多孔BC-PLGA-HA復合支架表面噴金后放置樣品臺進行掃描電鏡觀察。

2.1.2.2 抗張強度（δb）多孔BC-PLGA-HA復合支架裁剪成一定的形狀，用千分尺測其厚度和寬度。使用萬能電子拉力實驗機進行測試，根據公式 δb＝F/A（F：支架的最大拉力，A：支架的截面面積）計算出支架的抗張強度（δb）

2.1.2.3 孔隙結構測定 用乙醇裝滿一個小瓶記錄重量為W1，支架稱重記錄為Ws，然后浸泡于該瓶乙醇中，支架的孔中都充滿乙醇后，瓶子再加滿乙醇，稱重記錄W2，然后把浸滿乙醇的支架取出，剩余乙醇和小瓶稱重記錄為W3，ρ=0.79 kg/m3為乙醇的密度。根據以下公式計算孔隙率：

復合支架本身體積：Vs=（Wl+Ws-W2）/ρ

復合支架孔體積：Vp=（W2-W3-Ws）/ρ

復合支架孔隙率：ε=Vp/（Vs+Vp）=（W2-W3-Ws）/（W1-W3）

2.1.3 多孔BC-PLGA復合支架體外生物相容性分析

2.1.3.1 MG-3細胞在支架表面的形態學觀察 MG-63細胞從凍存管復蘇后培養換液，2.5 g/L胰酶常規傳代，倒置相差顯微鏡下觀察生長狀態，選取生長良好的第3代細胞在24孔板內以2×105/mL的細胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復合支架表面，置于37℃、體積分數為5%CO2恒溫培養箱中進行培養，隔天換液。培養5 d后取出標本，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，樣本表面噴金后電鏡掃描觀察。

2.1.3.2 MTT比色法檢測細胞在支架材料表面的增殖 MG-3細胞在24孔板內以2×105/mL的細胞濃度接種至多孔BCPLGA-HA復合支架表面，培養1、3、5 d后各孔內分別加入MTT液100 μL，37℃孵育4 h。吸出孔內液體后每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），振蕩 10 min，吸取上清液用酶聯免疫分光光度計 （490 nm）測定各孔光吸收值。同時以MG-3細胞直接接種于培養板底部作為對照組。

2.1.3.3 ALP活性檢測 MG-3細胞在24孔板內以2×105/mL的細胞濃度接種至多孔BC-PLGA-HA復合支架表面，培養5 d后取相應樣本，提取和制備支架材料上生長的全部細胞凍融液，參照ALP試劑盒和Braford試劑盒步驟測定細胞勻漿的中蛋白含量和ALP活性。同時以MG-3細胞直接接種于培養板底部作為對照組。結果進行統計學分析。

2.2 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，對MTT實驗所得數據采用重復測量數據方差分析法，對ALP檢測所得數據采t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2.3 結果

2.3.1 多孔BC-PLGA-HA復合支架相關理化性能分析

2.3.1.1 表面形貌觀察 支架內部可見各種裂隙樣或孔洞樣的結構將材料分割為多孔的海綿狀，孔大小為20～200 μm不等，部分孔表面可見覆蓋膜樣結構。10 000倍電鏡下可見粒徑約為幾百納米到幾個微米形狀不規則的HA分布在不平整的PLGA膜上。制備的多孔BC-PLGA-HA復合支架掃描電鏡觀察見圖1、2。

2.3.1.2 抗拉強度結果 本實驗制備的多孔BC-PLGA-HA復合支架的抗張強度測試結果為（8.923 1±0.901 2）N/mm2，理論上能夠滿足一定的組織工程支架力學的要求。

2.3.1.3 孔隙率測定 在測定支架的孔隙率時發現，所制備的多孔支架沒有發生明顯的溶脹現象，保持了原來的大小和形貌。本實驗制備的多孔BC-PLGA-HA復合支架的孔隙率測定結果為（64.73±5.65）%，提示所得支架具有較好的內部貫通結構。

2.3.2 多孔BC-PLGA復合支架體外生物相容性分析

2.3.2.1 MG-3在支架表面的形態學觀察 培養5 d后有一定數量的細胞黏附在復合支架表面并開始增殖（圖3），細胞與支架表面貼壁緊密，細胞間以偽足連接，已達到一定程度的匯合，胞體豐滿，折光較為明顯，部分細胞已經深入到材料表面裂隙中生長。

2.3.2.2 MG-3在支架材料上的增殖活性檢測 重復測量方差分析結果顯示，不同實驗組差異有統計學意義（P<0.001）；不同時間組差異有統計學意義（P<0.001）；其中，第1天多孔BC-PLGA-HA組和空白對照組間光密度值差異無統計學意義（P=0.217），第 3、5天多孔 BC-PLGA-HA 組的光密度值均高于對照組（P＜0.005），差異有統計學意義，提示MG-3細胞在多孔BC-PLGA-HA支架材料表面具有更強的增殖活性。MTT法測定多孔BC-PLGA-HA組和對照組細胞的成活和增殖能力結果見圖4。

2.3.2.3 MG-3在支架材料上的ALP活性檢測 MG-63細胞在多孔BC-PLGA-HA組和對照組培養基中生長5 d后，測定ALP表達，結果顯示，多孔BC-PLGA-HA組高于對照組，差異有統計學意義（t=4.207，P<0.05），表明多孔 BC-PLGA-HA復合支架材料更有利于成骨細胞生長分化和成骨活性的表達。見表1。

表1 成骨樣細胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

表1 成骨樣細胞MG-63的蛋白濃度和堿性磷酸酶活性（±s，n=4）

組別 測定管吸光度標準管吸光度樣品蛋白濃度（gport/L）ALP活性（金氏單位）多孔BC-PLGA-HA組對照組0.097±0.007 0.017±0.002 0.251±0.005 0.251±0.005 1.48±0.17 1.41±0.03 26.21±0.11 4.33±0.08

3 討論

生物支架是組織工程重要要素之一，對種子細胞起到支撐和模板作用，是其附著的基本框架和代謝場所，支架的孔結構形狀、尺寸大小和孔隙率對細胞的黏附、增殖和分化有著很重要的影響，但具體多大孔徑為最佳目前尚未有統一的說法，Freyman等[1]認為孔徑為 100～200 μm 較適合細胞生長。此外支架的高孔隙率（>90%）和相互貫穿的孔形態有利于細胞的種植生長、營養物質的傳輸以及血管和神經的內生長，但孔徑和孔隙度的[2]增加同時會降低支架的生物力學強度。

支架材料種類的選擇和制備方法對支架性能的影響有著重要的影響。本課題將BC、PLGA和HA三種材料通過溶液澆鑄/粒子瀝濾法制備多孔BC-PLGA-HA復合支架，基于如下考慮：（1）溶液澆鑄/粒子瀝濾法是較為成熟的制備可控孔徑多孔生物支架的方法[3]；（2）HA中有接近正常骨組織鈣/磷比，同時具有良好的骨傳導性[4]；（3）PLGA降解后在局部積聚的酸性代謝物容易引起無菌性炎癥發生。HA表面溶解后呈弱堿性，能夠緩沖或中和PLGA降解產生的酸[5]；（4）BC有著良好的理化性能[6-7]：①具有厚度為3～8 nm的納米級超細纖維，大小僅為人工合成纖維的1/10；②具有高抗張強度和彈性模量，揚氏模量可達1.5×1010Pa，抗撕能力比聚乙烯膜和聚氯乙烯膜要強5倍；③具有良好的持水性和透氣性能，內部有很多“孔道”使其能吸收60～700倍于其干重的水份。預期BC的加入可以補償材料因降解過程中產生的物理機械性能下降，從而使復合支架在修復功能區和負荷區時可以較長時間地保持良好的力學性能。本課題選用粒徑為100～200 μm的造孔劑，掃描電鏡觀察制備的多孔BC-PLGA-HA復合支架呈多孔狀結構，孔形狀略不規則，大小20～200 μm不等，孔的形狀可能和造孔劑形狀相關，出現部分較小孔徑原因可能是在篩選造孔劑時混雜有小部分更小尺寸造孔劑所造成。高倍率下可見粒徑不等的HA散在支架孔的底部。

抗拉強度和孔隙率是衡量生物材料理化性能的兩個重要指標。材料斷裂前所達到的最大應力值稱為抗拉強度，它可以代表材料的部分力學性能。孔隙率和材料的親水性相關，通常孔隙率越高，材料的吸水率就越高，生物相容性就越高。本課題所制備的多孔BC-PLGA-HA復合支架孔隙率為（64.73±5.65）%，抗拉強度（8.923 1±0.901 2）N/mm2，能夠同時具有較高的力學強度和孔隙率，高強度可能來源于BC的本身的優良物理機械性能和支架制備時PLGA溶液滲透入BC內部立體網狀結構并與其牢固結合有關，高孔隙率可能和BC本身的高親水性和支架的多孔結構有關。因此有望用于修復人體功能和負荷區。

本實驗將成骨樣細胞MG-3植于多孔BC-PLGA-HA復合支架上體外培養5天后電鏡掃描結果顯示：細胞能夠緊密黏附并有所伸展，達到一定程度的匯合并已開始增值，表明細胞生長狀況良好。MTT檢測結果顯示培養1 d后多孔BCPLGA-HA組與對照組組間數值差異無統計學意義（P＞0.05），可能是因為在接種早期MG-3細胞處于潛伏適應期，支架材料對其增殖的影響作用尚未發生；培養3～5 d，多孔BC-PLGAHA組細胞增殖速度明顯快于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。在培養5 d后測量MG-3細胞內ALP的活性發現：多孔BC-PLGA-HA組細胞內的ALP的合成量明顯高于對照組。說明多孔BC-PLGA-HA復合支架更有利于MG-3細胞的增殖和成骨分化。

綜上所述，本課題采用溶劑澆鑄法制備的多孔BC-PLGAHA復合支架具有良好的力學性能、孔隙率和生物相容性，有望作為修復功能區和負載區的生物材料，為組織工程支架材料提供新的選擇和思路。針對缺點與不足，實驗在支架的制備、理化性能和生物相容性方面進行了初步的探討，有關復合支架其他相關性能、支架成分對支架本身性能的影響等方面內容，還需要進更多的實驗來進行分析和討論。

[1]Freyman TM，Yannas IV，Gibson LG.Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering[J].Progress in materials science，2001，46：273-282.

[2]Chang BS，Lee CK，Hong KS，et al.Osteoconduction at porous hydroxyapatite with various pore configurations[J].Biomaterials，2000，21（12）：1291-1298.

[3]Mikos AG，Sarakinos G，Vacanti JP，et al.Biocompatible Polymer Membranes and methods of preparation of three dimensional membrane structures[J].United States Patent，1996：122.

[4]Legeros RZ.Properties of osteoconductive biomaterials：calcium phosphates[J].Clin Orthop，2002，395（2）：81-98.

[5]Rezwan K，Chen QZ，Blaker JJ.Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic compositese scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials，2006，27（18）：3413-3431.

[6]Henrik B，Bo R，Paul G.Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft[J].Carbohydrate Polymers，2011，31（1）：14-21.

[7]Magdalena Z，Aase B，Henrik B，et al.Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regeneration[J].Acta Biomaterialia，2010，6（7）：2540-2547.