肌萎縮側索硬化患者腦脊液對間充質干細胞增殖分化的影響

王云甫 楊 超 孫延鵬 孫 強 盧祖能

肌萎縮側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是運動神經元疾病的主要類型，是一種進行性神經變性疾病，由于上、下運動神經元變性導致延髓、四肢、軀干、胸部及腹部肌肉逐漸無力和萎縮，多因呼吸肌麻痹而死亡其發病機制至今尚未完全清楚，也無特效治療。近年來隨著發病機制的研究，提出了許多神經保護性治療措施，其中干細胞移植被認為是一種最有前景的治療措施［1，2］。本實驗在成功分離大鼠MSCs的基礎上通過體外模擬細胞移植的CSF微環境，將ALS患者和正常CSF分別與MSCs共培養，比較MSCs在不同CSF中向神經元細胞增殖分化的程度，初步探討MSCs在不同CSF微環境中增殖分化的啟動機制，為臨床MSCs經CSF移植治療ALS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 成年健康SPF級SD（Sprague-Dawley）大鼠10只（雌雄不限），體重300 g左右，購自湖北醫藥學院動物實驗中心。主要試劑：低糖DMEM培養基、胎牛血清FBS及小鼠抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45 單 克 隆 抗 體 購 自 美 國Gibco公司。兔抗大鼠NESTIN抗體及兔抗大鼠NSE抗體均購自武漢博士德公司。腦脊液來源于湖北省十堰市太和醫院神經內科的住院患者。CSF的獲得均經過知情同意，在無菌原則下選擇腰椎3-4或4-5椎間隙穿刺。ALS患者的診斷符合1998年修訂版E1 Escorial標準。病例對照組為住院頭痛患者，經過腦和脊髓影像學檢查排除運動神經元病、顱內感染、多發性硬化、腦梗死、腦出血及中樞神經系統腫瘤等疾病，且腰穿CSF常規、生化及細胞學檢查均正常。

1.2 大鼠骨髓MSCs的原代培養及生物學鑒定采用密度梯度離心聯合貼壁培養的方法分離、培養大鼠骨髓MSCs。健康成年SPF級SD大鼠經過脫臼處死后，75%乙醇侵泡5min后，無菌分離雙側后肢股骨及脛骨，剪去包括骺板在內的骨兩端，用10%FBS完全培養基反復沖洗骨髓腔，將骨髓沖入培養皿，反復吹打骨髓細胞懸液至骨髓均勻分散，以106／cm2的密度接種于培養瓶中，加入5 ml低糖DMEM（含10%的胎牛血清、青霉素100 u／ml、鏈霉素100 u／ml）的培養液，置5%的CO2、37℃的細胞培養箱內，培養48 h后換液，去掉懸浮的細胞，收集貼壁細胞繼續培養，之后每隔3 d換液1次。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀況，當細胞生長至80%融合時，進行細胞傳代培養。取生長狀態良好的第3代（P3）細胞分別加入CD29、CD34、CD44、CD45等單克隆抗體，應用流式細胞儀檢測細胞表面抗原的表達，進行細胞表型鑒定。

1.3 大鼠骨髓MSCs的共培養 取生長狀態良好的第3代（P3）細胞，按0.5×105cells／孔的濃度接種于24孔培養板中，孔中預先放置好經過多聚賴氨酸處理的無菌蓋玻片，用以細胞爬片，待細胞生長至80%左右融合時，吸出培養基，將培養板隨機分為3組：ALS患者組、病例對照組、空白對照組。ALS患者組每孔加入10 ul ALS患者CSF和1ml培養基，病例對照組每孔加入10 ul正常CSF和1 ml培養基，空白對照組每孔僅加入1 ml培養基。

1.4 細胞增殖活性測定（MTT法） 分別于共培養后第1、4、7 d棄去原培養基，加入 MTT（5 mg／ml）溶液20 ul，37℃二氧化碳孵箱內孵育4 h，小心吸取MTT溶液后，加入二甲基亞砜0.5 ml，振蕩15 min，酶標儀上選擇波長490 nm，測定吸光度（A）值。

1.5 免疫熒光檢測Nestin及NSE的表達水平分別另取上述3組共培養7 d的細胞爬片，吸出培養基，用4%多聚甲醛2 ml固定30 min，蒸餾水洗凈后晾干，各組細胞按抗體說明書分別行Nestin和NSE免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分離培養及鑒定 以密度梯度聯合貼壁培養法獲得的骨髓MSCs接種1d后，倒置相差顯微鏡下可見大部分細胞貼壁生長，貼壁細胞為圓形、橢圓形，有突起，集落樣生長，但仍然殘留懸浮細胞；48 h首次換液后，在倒置相差顯微鏡下可見貼壁細胞數量增多，部分聚集成片，并有部分細胞呈扁平梭形，仍有少許懸浮細胞，至第7 d，梭形細胞明顯增多，集落逐漸擴大，僅有微量懸浮細胞，貼壁細胞呈梭形，細胞融合約達80%。第3代以后細胞純度不斷提高，形態較為單一，大多數為長梭形，放射狀排列（圖1）。經流式細胞儀檢測，細胞陽性表達CD29（97.15%）和CD44（98.21%），陰性表達造血干細胞標志物CD34（6.05%）和CD45（6.12%），符合 MSCs的細胞表型特征［3，4］。

圖1 原代（A）和第3代（B）骨髓間充質干細胞（倒置相差顯微鏡×100倍）

2.2 共培養后細胞的增殖活性測定 隨共培養時間的延長，各組細胞的增殖能力逐漸增加；不同的共培養環境，各組細胞的增殖能力不同。ALS組與病例對照組各時間點吸光度值（A）均明顯高于空白對照組，而ALS組與病例對照組各時間點吸光度值（A）無統計學差異，見表1。

表1 各組共培養細胞不同時間點吸光度值（±s，n＝5，A）

表1 各組共培養細胞不同時間點吸光度值（±s，n＝5，A）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.01；與病例對照組比較，△P＞0.05

組別 吸光度值1 d 4 d 7d ALS組 0.252±0.026＊△0.747±0.042＊△ 1.173±0.067＊△036病例對照組 0.227±0.028＊ 0.696±0.051＊ 1.098±0.059＊空白對照組 0.137±0.019 0.436±0.052 0.939±0.

2.3 共培養后MSCs Nestin、NSE免疫熒光染色

MSCs和不同CSF共培養7 d后部分細胞開始收縮，并出現細胞突起等出一般形態學變化，出現神經元細胞及神經膠質樣細胞形態，而空白對照組細胞形態仍然保持典型的梭形細胞形態。Nestin（圖2）、NSE（圖3）免疫熒光染色顯示，ALS患者組和病例對照組均有陽性細胞表達，光鏡下隨機數取10個非重疊視野（×100倍），計算Nestin、NSE陽性細胞占總細胞數的比例發現，ALS組與病例對照組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于空白對照組，且ALS組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于病例對照組，見表2。

圖2 各組細胞共培養7 d后的Nestin免疫熒光染色（光學顯微鏡×100倍）

圖3 各組細胞共培養7d后的NSE免疫熒光染色（光學顯微鏡×100倍）

表2 各組MSCs共培養7 d后表達Nestin和NSE的陽性細胞率 （xˉ±s，n＝10，%）

3 討 論

神經系統難治性疾病大多數是由于神經系統損傷而導致大量神經元結構和功能缺失，神經損傷之所以難以逆轉是因為神經纖維缺乏再生能力，嚴重影響疾病的治療和患者的臨床預后轉歸，成為人們面臨的難題。干細胞移植治療，可從結構和功能上對神經系統進行修復和改善，在一定的條件下骨髓MSCs可以跨胚層分化成神經元樣細胞。骨髓MSCs取材和體外擴增較方便，不受倫理學限制，且具有免疫原性弱的特點，可自體移植也可異體移植。近年來，MSCs移植治療ALS已成為臨床研究的熱點［5，6］。

目前大多數研究表明，骨髓MSCs在缺血或損傷的腦和脊髓組織中向神經細胞方向的分化與局部損傷組織的微環境變化有關，特別是細胞因子如腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），表皮生長因子（epidernal growth factor，EGF）、血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）等的作用。神經損傷時這些細胞因子表達增加，從而促進骨髓MSCs向神經細胞分化［7］。損傷的機體能發出某種特異的分子信號，將干細胞募集到損傷部位并發揮其組織修復功能。干細胞移植并遷移定位到某組織后，在體內微環境的作用下，能定向分化成為所需的組織細胞類型或者可以通過模擬體內微環境，在體外實現干細胞的定向誘導分化。

骨髓MSCs的自我更新、增殖、遷移、分化與其所處的特殊微環境密切相關［8］。CSF中含有多種電解質、蛋白質、糖和其他因子：例如bFGF、BDNF、GDNF等［9，10］。本研究采用不同來源的 CSF分別與MSCs共培養發現，ALS組與病例對照組的CSF均能促進MSCs的增殖，兩組細胞的增殖能力無明顯差異；培養后7 d可見大量具有典型神經細胞形態的神經元樣細胞，且表達神經元特異性表面標志（Nestin、NSE），且ALS組Nestin、NSE陽性細胞率均明顯高于與病例對照組空白對照組。我們推測，MSCs的分化需要一定的微環境，不同的CSF為骨髓MSCs的成神經分化提供了不同的微環境；ALS患者的CSF可能存在某些損傷因子，更能促進MSCs向神經元樣細胞的分化，從而參與了MSCs定向分化和神經組織修復機制的啟動環節。

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5 Delorme B，Chateauvieux S，Charbord P.The concept of mesenchymal stem cells.Regen Med，2006，1（4）：497-509.

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7 Chen X，Katakowski M，Li Y，et al.Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts：growth factors production.J Neurosci Res，2002，69（5）：687-691.

8 Spradling A，Drummond-Barbosa D，Kai T.Stem cells find their niche.Nature，2001，414（6859）：98-104.

9 Grundstrom E，Lindholm D，Johansson A，et al.GDNF but not BDNF is increased in cerebrospinal fluid in amyotrophic lateral sclerosis.Neuroreport，2000，11：1781-1783.

10 Huang CC，Liu CC，Wang ST，et al.Basic fibroblast growth factor in experimental and clinical bacterial meningitis.Pediatric Research，1999，45（1）：120-127.