血管性癡呆大鼠海馬DG區幾種氨基酸含量的變化

元藝蘭 樸虎男 吳 光 崔松彪

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由一系列腦血管因素（包括腦缺血、腦出血或急慢性缺血缺氧性腦血管病等），導致腦組織損害而引起的，以記憶、認知功能障礙為特征的獲得性智能損害綜合征。它具有發病率較高、致殘率較高等特點，但也是老年期癡呆中僅有的可預防和治療的一種癡呆［1］。目前為止，雖然很多臨床資料和基礎研究證明VD的發病與腦血管疾病、動脈粥樣硬化、高血壓病、糖尿病、肥胖、代謝綜合征、心臟病、高纖維蛋白原血癥、高血粘度、長期吸煙酗酒等諸多因素有關，而且還和病灶的性質也密切相關［2，3］，但其發病的確切機制尚不完全清楚。因此，為了初步探討與VD記憶認知障礙相關的海馬區神經化學機制，本研究以雙側頸總動脈永久性結扎的方法制備VD模型大鼠，并以在大鼠空間學習記憶中起關鍵作用的海馬齒狀回（Dentate gyrus，DG）區為研究對象，利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察了細胞外液中幾種氨基酸類神經化學物質的含量變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗采用清潔級Wistar系雄性大鼠，體重在250～300克，由吉林大學動物實驗中心提供。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分成3組：對照組6只，不作手術；假手術組6只，剝離雙側頸總動脈，但不結扎；模型組6只（VD組）：剝離雙側頸總動脈，并進行永久性結扎。

1.3 VD大鼠模型的制備 經過多次預實驗，我們采用改良的雙側血管阻斷（2-VO）法［4］來建立 VD大鼠模型。具體操作為選取健康雄性wistar大鼠，手術前禁食不禁水8～12 h，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）進行麻醉，待大鼠深度麻醉后將大鼠仰臥固定，頸部皮膚剃毛備皮，并進行碘伏酒精常規消毒；于頸部正中央切口，鈍性剝離皮下組織，在切口正下方的胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌的交界處（即Y形溝內）可以找到手觸之有搏動感、粉紅色較粗大血管，即頸總動脈；小心剝離出一側頸總動脈后，采用4號手術線結扎；以青霉素粉于局部傷口處處理，縫合傷口；7 d后同樣方法進行另一側頸總動脈結扎。假手術組只做剝離不結扎，對照組不做剝離手術。VD組和假手術組，兩組手術大鼠術后單獨籠養1周后合籠飼養。

1.4 行為學檢測 采用Morris水迷宮系統，該系統包括一個直徑130 cm、高50 cm的圓形水池，一個水中平臺和懸掛在水池上端的記錄裝置三部分（圖1）；實驗水深30 cm，水溫（20±2）℃；池壁上標有4個對稱的入水點，分為東、南、西、北，并以此為中心將水池分為4個象限，選其中任一象限中央放置平臺，平臺及整個水池內部漆成黑色；平臺高度為28 cm，直徑為10cm，使平臺距水平面1.5～2.5 cm；水迷宮上方的攝像頭用來隨時記錄大鼠的運動軌跡；整個訓練期間水迷宮外各種布置保持不變，訓練時光源等應一致，保持周圍環境安靜；造模前和造模30 d后各進行Morris水迷宮訓練和檢測1次，用來評估手術前后大鼠學習記憶改變；每次訓練開始前1 d，為了讓大鼠熟悉環境，讓大鼠在水池中自由游泳3 min，此時撤出平臺；為了評估大鼠的空間學習和記憶能力，我們進行大鼠定位航行實驗，設定為每天訓練4次，第5次進行測試，共需5 d完成；將大鼠從入水點背向水池中央放置，記錄60 s內大鼠從入水到爬上平臺所需的時間，即逃避潛伏期；有的大鼠在60 s內能夠找到平臺，讓其在平臺上站立10 s，有的大鼠找不到，將大鼠引上平臺，并讓其停留10 s，此時潛伏期記為60 s。

圖1 Morris水迷宮行為學檢測系統

1.5 海馬區微量透析探針及其外套管固定手術

大鼠用10%水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后頭部去毛備皮，將大鼠腹臥位固定于立體腦定位儀上；根據Paxinos和Watson所繪制的大鼠腦圖譜，將透析探針外套管插入到DG區；DG區定位以前囟為參考點，后退3.1～3.3 mm，旁開（左右皆可）1.9～2.1mm，深度為高于DG區1.5 mm的位置，然后用牙托粉將其固定在大鼠顱骨上；術后把大鼠放在長30 cm，寬30 cm，高35 cm的實驗用不透明的塑料小箱中飼養；第2 d大鼠狀態恢復后經外套管將透析探針插入到海馬DG區，用蠟將探針固定在外套管上，探針超出外套管1.5 mm（前端附有半透膜），待大鼠安靜后進行腦部微量透析實驗；微量透析探針及其外套管埋入（圖2）。

圖2 微量透析探針及其外套管的埋入位置模式圖

1.6 微量透析樣本的收集和氨基酸含量的測定 根據Jin等的方法［5］，微量透析探針連接微量泵，向大鼠海馬DG區灌流Ringer’s液，流速為1.5μL／min，待穩定90 min后開始進行樣本收集，每管收集量為15 μL，收集10min，保存在－80℃冰箱，以備進行氨基酸含量分析；每只大鼠收集3個管，取其平均值；氨基酸含量測定采用高效液相色譜和電化學檢測系統（ECD-300），取12μL樣本和4mM 的 OPA 溶液3 μL，混勻在室溫下反應2.5 min，抽取上述溶液10μL，通過手動進樣口注入到系統中進行分析，其參數為流動液流速：0.5 mL／min，壓力＜10 Mp。

1.7 組織學鑒定 待樣本收集完后將大鼠麻醉處死，小心剝離腦組織，固定在10%甲醛溶液中，采用連續手動冰凍切片法做厚度為60μm的腦切片，干燥1 d后即可在顯微鏡下觀察。

1.8 統計學處理 所有實驗數據均用平均值±標準誤（means±SE）表示，采用t檢驗或單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 VD模型大鼠空間學習記憶能力

造模前對照組、假手術組和VD組大鼠的逃避潛伏期隨著訓練天數的增加逐漸縮短，各組間無顯著性差異（表1）。造模30 d后對照組和假手術組與造模前相似，其逃避潛伏期也隨訓練天數的增加而明顯減小，而VD組的逃避潛伏期雖然也有隨訓練天數而減小的傾向，但減小幅度緩慢，與對照組和假手術組相比較有顯著性差異（表2）。

2.2 組織學鑒定

根據Paxinos ＆ Waston的大鼠腦圖譜，對腦切片標本進行了組織學鑒定。圖3是一張典型的組織學顯微鏡照片，圖中透析探針位于海馬DG區。定位不準確者不計入統計。

表1 造模前各組大鼠逃避潛伏期的比較（s）

表2 造模30 d后各組大鼠逃避潛伏期的比較（s）

圖3 微量透析探針位置標記圖

2.3 VD模型大鼠海馬DG區細胞外液中幾種氨基酸含量的變化

假手術組與對照組比較，7種氨基酸的含量均無明顯變化（P均＞0.05）；VD組與對照組及假手術組比較，Gln、Tau、Ala和GABA的含量明顯增加（P均＜0.01），而Asp、Glu和Gly的含量沒有明顯差異（P均＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠海馬DG區細胞外液中的氨基酸含量（用高效液相色譜圖上的波形所占面積表示）

3 討 論

VD是因腦血管疾病所致的癡呆，在我國是老年期癡呆的主要類型，對它的研究和認識成為人們日益關注的熱點。海馬是機體完成學習記憶活動的關鍵結構，海馬區的包括氨基酸類在內的多種神經化學物質參與學習記憶功能。有研究指出，VD的記憶認知障礙和海馬區的病理變化密切相關［6－9］，然而對于VD記憶認知障礙和海馬區氨基酸類物質含量的關系目前報道罕見。VD大鼠模型的制備方法比較多，有3血管閉塞法、4血管阻斷法、急性大腦中動脈梗 死 法、雙 側 頸 總 動 脈 結 扎 法 等［4，10，11］。 經過反復的預實驗，我們采用了改良的雙側頸總動脈永久性結扎法，即在實行雙側頸總動脈結扎法的時候，將兩側頸總動脈結扎間隔延長為1周，而且在術后1 d內將大鼠進行分籠飼養。此方法制備VD模型，動物存活率較高，而且模型的成功率也大大提高。

血管性癡呆的發病機制一般認為是腦血管病的病灶涉及額葉、顳葉及邊緣系統，或病灶損害了足夠容量的腦組織，導致記憶、注意、執行功能和語言等高級認知功能的嚴重受損。隨著近幾年各種科學技術，尤其是生物技術研究手段的發展，VD的發病機制的研究取得了一些進展，但到目前為止仍然沒有對VD的發病機制有一個完整的闡述。本實驗以改良的雙側頸總動脈結扎法制備VD模型，并采用微量透析法和高效液相色譜法測定了清醒大鼠海馬DG區7種氨基酸（包括Asp、Glu、Gln、Gly、Tau、Ala和GABA）的含量，本實驗結果顯示VD模型大鼠海馬DG區Gln、Tau、Ala和GABA含量明顯增加。

腦內Glu代謝的前體物質是Gln，因此Gln對腦功能發揮調節作用可能是通過Glu遞質系統起效的，也有研究報道，在腦片培育實驗中可以發現Gln可以產生海馬穿通通路纖維中80%的Glu［12］。因為以前對于Gln的營養學研究主要集中于其對創傷、感染、手術等急性應激狀態下的腸內外營養支持。近年研究表明，Gln可以通過調節神經系統功能來治療記憶障礙這一腦出血后遺癥，同時也可以促進兒童的智力發育，尤其是智力發育不全的兒童效果更佳，并且還參與治療帕金森氏綜合征和防止癜癇間發作［13］。Tau是一種能增強大鼠學習記憶的作用的必需氨基酸，這歸功于其能促進神經系統生長發育、增殖分化的作用；Tau增強大鼠學習記憶能力最初啟動的腦區可能是顳葉皮層、海馬、下丘腦和丘腦等區域，而且它還參與細胞間的信息傳遞［14］。有研究報道，在清醒大鼠學習記憶活動過程中海馬DG區的Gln和Tau明顯增加，提示Gln和Tau可能參與海馬DG區的學習記憶功能活動中［6］。本研究結果顯示VD模型大鼠海馬DG區Gln和Tau含量增加，但卻伴有學習記憶水平的下降，提示VD記憶障礙中可能出現Tau和Gln的代償性增加，但也不能排除兩者作為VD記憶障礙產生原因的可能性。另外，本實驗結果還顯示，VD模型大鼠DG區的Gln含量增加并沒有伴有Glu濃度的變化，其可能的機制有待于進一步研究。

Ala和Gly都是人體中重要的抑制性氨基酸。它分子量較小，極易通過血腦屏障發揮作用。Ala經Ia類傳入纖維興奮，激活抑制性中間神經元而釋放至突觸間隙，與突觸后膜特異性受體結合，開啟Cl－通道引起突觸后膜超級化。然而哺乳動物不同腦區切片顯示，脊髓、延髓和腦橋等存在著親和力攝取系統，只是親和力不如Gly那樣高［14］。目前，對Ala和學習記憶的關系尚未見報道。眾所周知，GABA對中樞神經元有普遍性的抑制作用。中樞谷氨酸／γ－氨基丁酸（glutamic acid，Glu／GABA）是參與學習、記憶的關鍵和必須的氨基酸，并且兩者起著相反的作用，對學習、記憶起正性調節作用氨基酸為Glu，反之為GABA，二者之間的對立統一關系，兩者都不可忽視。本實驗結果顯示，VD模型大鼠海馬DG區內Ala和GABA均明顯增加，提示它們可能作為抑制性遞質參與VD的記憶認知障礙過程中。

雖然本實驗的結果提示海馬DG區的Gln、Tau、Ala和GABA可能與VD的記憶認知障礙有關系，但其具體的作用機制和相互關系還有待于進一步研究。

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