糖氧剝奪誘導神經元磷酸化Rb蛋白表達特點及其與凋亡關系研究

余 櫻 張兆輝 喻志源 王 偉

視網膜母細胞瘤蛋白（Retinoblastoma protein，Rb）及其相關蛋白（p107，p130）被認為是細胞周期G1／S期轉變的“檢驗點”。在應對中樞神經系統損傷時，終末分化的成熟神經元保留細胞周期再活化的能力，嘗試通過“檢驗點”再次進入細胞周期。有研究發現神經元暴露在不同的死亡刺激中均能檢測到磷酸化的Rb［1］，提示Rb信號途徑可能在缺血后神經元凋亡中起重要作用，但是Rb和神經元凋亡的準確關系、參與神經元凋亡的具體機制仍然不明確。本研究采用離體培養的皮層神經元糖氧剝奪（Oxygen-glucose deprivation，OGD）再給氧實驗，探討OGD誘導體外培養的神經元細胞內磷酸化Rb（phospho-Rb，p-Rb）的表達變化特點及其與神經元凋亡的關系，嘗試從神經元細胞周期調控的角度來闡述缺血缺氧誘導神經元凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 大鼠皮層神經元的原代培養

按照Katchanov的方法［2］稍加改進。取24 h內新生的SD大鼠大腦皮層，0.125%胰酶-0.02%EDTA37℃消化15 min，1000 r／min室溫離心3 min，棄上清，在含10%胎牛血清的DMEM／F12培養液中重懸，吹打分散成細胞懸液，經直徑70μm的篩網過濾，以3.5×105／ml的細胞密度接種于多聚賴氨酸（0.1 mg／ml）包被過的24孔板中，于37℃5%CO2培養箱內培養，第2 d更換神經元培養基（Neurobasal-A＋2%B27＋0.5 mM L-谷氨酰胺），以后每3 d半量換液一次，選取第7 d的細胞進行實驗研究。

1.2 糖氧剝奪模型制備

參考Gwag的方法［3］制備OGD模型。將培養的皮層神經元隨機分為對照組、糖氧剝奪1 h后恢復糖氧供給（OGD／R）6、12、24 h組。OGD／R各組神經元加入不含糖Earl’s平衡鹽溶液（EBSS：116.4 mM NaCl，0.8 mM MgSO4，5.4 mM KCl，2.6 mM NaH2PO4，26.2 mM NaHCO3，1.8 mM CaCl2，and 20.1 mM HEPES pH7.4）后放入缺氧培養箱（93%N2，5%CO2，＜2%O2）37℃培養1 h，對照組加入含糖EBSS（EBSS加5.6 mM葡萄糖）放入正常條件培養箱37℃培養1 h。此后，對照組和OGD／R各組神經元均換成神經元培養基正常條件培養，規定時間點取出細胞進行相關檢測。

1.3 OGD／R各時間點神經元微管相關蛋白2（Microtubule-associated protein 2，MAP-2）與p-Rb免疫熒光細胞化學雙標記染色

各組細胞爬片于相應時間點去除培養基，PBS漂洗，甲醇室溫固定15 min，0.2%Triton-PBS液中透膜15 min，加封閉液（10%BSA-PBS）室溫封閉2 h，滴加比例稀釋的小鼠抗 MAP-2單克隆抗體（Chemicon，1∶100）和兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗體（Cell Signaling，1∶100）4℃孵育過夜，棄一抗，滴加CY3標記羊抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）和FITC標記羊抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch，1∶200）室溫避光孵育40 min，棄二抗，滴加核染料DAPI（5 mg／ml）復染10 min，流水沖洗后50%甘油封片。

1.4 細胞凋亡（TUNEL）染色與p-Rb雙標記熒光染色

TUNEL染色方法按照試劑盒（Clontech）說明書進行操作。各組細胞爬片于相應時間點固定、透膜，滴加Equilibration Buffer室溫放置10 min，滴加TdT Incubation Buffer混合液濕盒中37℃避光孵育1 h，2×SSC Buffer室溫終止反應，滴加上述比例稀釋的兔抗磷酸化Rb（ser 795）多克隆抗體4℃孵育過夜，依次滴加羊抗兔CY3二抗、核染料DAPI孵育，沖洗封片如上述。熒光顯微鏡下觀察、照相。計算隨機不重復的6個高倍（×400倍）視野下TUNEL或p-Rb陽性細胞數或兩者共定位細胞占DAPI數量的百分比（n＝3），計算陽性率。

1.5 統計學處理

采用SPSS11.0統計軟件。實驗數據均以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，繼以LSD進行兩組間差異性檢驗。

2 結 果

2.1 OGD誘導神經元 MAP-2與p-Rb表達的特點

對照組 MAP-2在神經元胞漿表達，顯示神經元胞體呈錐體狀，形態完整，突起分2～3支，細長連續，與相鄰神經元突起之間相互連接成網，僅有少數神經元胞核或者胞漿有p-Rb弱表達。OGD／R6 h組觀察到MAP-2顯示神經元的突起斷裂不連續，p－Rb主要在神經元胞漿表達，表達率較對照組增多，達到神經元總數的20～30%。OGD／R12 h，神經元突起斷裂，相互之間失去連接，網絡紊亂，此時p－Rb的表達達到高峰，約有40～50%的神經元p-Rb在胞漿強表達。OGD／R24 h，約有將近一半的神經元結構不完整，破碎零散，p-Rb表達稍有減少。

2.2 OGD誘導神經元p-Rb表達與凋亡的關系

對照組中只有5%～10%的神經元p-Rb在胞漿內弱表達，極少能與TUNEL染色共定位。OGD／R6 h，p-Rb表達增強，凋亡細胞數開始增多，兩者共定位的細胞比例增高，OGD／R12 h，p-Rb表達達到高峰時，幾乎所有凋亡的細胞均與p-Rb共定位（圖1）。OGD／R 24 h時雖然p-Rb表達和TUNEL均維持在比較高的水平，但是很少觀察到兩者共定位表達（圖1），提示Rb磷酸化可能參與OGD誘導的神經元早期凋亡過程。

3 討 論

圖1 各組神經元p-Rb標記、TUNEL標記和兩者共定位標記的細胞比例

既往認為神經元為終末分化細胞，一旦分化完成，就不能再進行分裂增殖。精確調控細胞周期進程對于維持神經元表型及存活十分關鍵。大量研究證據顯示在應對中樞神經系統損傷時，神經元保留了細胞周期再活化的能力，嘗試通過“檢驗點”再次進入細胞周期［4］。Rb被認為是神經元細胞周期再進入和可能引起凋亡的一個“門衛”［5］。非磷酸化狀態的Rb通過與轉錄因子E2F1結合阻滯其相關基因的轉錄而使細胞停留在G1期，而Rb翻譯后的磷酸化修飾參與神經元的細胞周期誘導［6］。Rb磷酸化導致E2F1／Rb復合物解離和E2F1釋放，促進細胞進入S期和凋亡［6］。有報道卒中模型中神經元表達磷酸化Rb增加［7，8］，但它參與神經元凋亡的具體機制不清楚。Rb磷酸化在腦缺血后神經元中表達如何變化，如何參與神經元的細胞周期調控并導致凋亡？本研究發現糖氧剝奪誘導的神經元損傷導致神經元細胞內Rb磷酸化表達增加，這些細胞在損傷早期即發生凋亡，提示Rb可能通過誘導缺血缺氧神經元細胞周期紊亂參與其早期凋亡過程。

MAP-2是神經元的細胞骨架成分，作為神經元的標記物，用來觀察OGD／R不同時間點神經元細胞骨架形態的變化。對照組中，MAP-2存在于神經元的胞漿和突起中，相鄰細胞突起相互交聯，連接成網絡。當遭受OGD損傷后，首先觀察到MAP-2標記的神經元突起斷裂不連續，接著突起之間失去連接，網絡紊亂，最后觀察到將近一半的神經元結構欠完整，部分破碎零散，表明OGD1 h后恢復糖氧供給處理成功地對培養的皮層神經元造成缺血缺氧損傷，為后續OGD誘導的神經元細胞周期改變及凋亡建立有效細胞模型。

本研究對培養的皮層神經元糖氧剝奪后再恢復糖氧供給，來誘導神經元損傷。我們的結果顯示神經元OGD處理后，ser 795位點磷酸化的Rb蛋白在早期（6 h和12 h）即表達迅速增加，提示這些神經元正常細胞周期調控已被打亂，同時，我們觀察到損傷早期大部分發生Rb磷酸化的神經元能與TUNEL染色共定位，說明OGD損傷的大部分神經元通過Rb磷酸化導致其原有的細胞周期紊亂，但是這些神經元最終結局不是增殖而是凋亡。

我們在研究中發現，神經元暴露于OGD處理后，p-Rb表達在復氧后6 h和12 h顯著增加，OGD／R12 h，p-Rb表達達到高峰時，幾乎所有TUNEL染色細胞均與p-Rb共定位，但在OGD／R 24 h，雖然p-Rb表達和TUNEL染色細胞比例均分別維持在比較高的水平，卻很少觀察到兩者共定位表達，提示Rb磷酸化介導的神經元細胞周期紊亂可能是OGD誘導的神經元早期凋亡機制之一。

Rb磷酸化能決定他自身與轉錄因子E2F1結合以及阻止E2F1轉錄的能力。Rb的磷酸化調控細胞通過G1期限定點并進入S期，是由細胞周期蛋白（cyclin）D，E，A和對應的細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）連續調節的過程。正常情況下神經元內的細胞周期蛋白是穩定而有序的表達，但是當神經元受到各種損傷刺激后，細胞周期蛋白被激活并無序紊亂表達，再表達的CDKs使Rb磷酸化并從轉錄抑制復合物E2F1／Rb上脫離，啟動E2F1依賴的凋亡蛋白（如p53，caspase家族，Bax等）的表達來誘導神經元凋亡［9，10］。根據細胞的狀態，E2F能誘導一些凋亡途徑：1）激活b-myb和c-myb基因；2）增加caspase-3，-9，-8和 Apaf-1的表達；3）激活p53和p73，p53和p73激活前凋亡Bcl-2家族成員，釋放線粒體前凋亡蛋白如細胞色素c等［9］。

總之，我們發現OGD處理的成熟神經元通過Rb磷酸化導致細胞周期紊亂，并誘導其發生早期凋亡，推測Rb磷酸化介導的神經元細胞周期紊亂可能是缺血缺氧誘導的神經元早期凋亡機制之一。

1 Park DS，Obeidat A，Giovanni A，et al.Cell cycle regulators in neuronal death evoked by excitotoxic stress：Implications for neurodegeneration and its treatment.Neurobiol Aging，2000，21（6）：771-781.

2 Katchanov J，Harms C，Gertz K，et al.Mild cerebral ischemia induces loss of cyclin-dependent kinase inhibitors and activation of cell cycle machinery before delayed neuronal cell death.J Neurosci，2001，21（14）：5045-5053.

3 Gwag BJ，Lobner D，Koh JY，et al.Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro.Neuroscience，1995，68（3）：615-619.

4 Malik B，Currais A，Andres A，et al.Loss of neuronal cell cycle control as a mechanism of neurodegeneration in the presenilin-1 alzheimer＇s disease brain.Cell Cycle，2008，7（5）：637-646.

5 Liu DX，Greene LA.Neuronal apoptosis at the G1／S cell cycle checkpoint.Cell Tissue Res，2001，305（2）：217-228.

6 Dick FA，Dyson N.p-RB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.Mol Cell，2003，12（3）：639-649.

7 Yu Y，Luo X，Ren QG，et al.The involvement of upregulation and translocation of phospho-rb in early neuronal apoptosis following focal cerebral ischemia in rats.Neurochem Res，2009，34（6）：1113-1119.

8 Lazzerini Denchi E，Helin K.E2F1is crucial for E2F-dependent apoptosis.EMBO Rep，2005，6（7）：661-668.

9 Byrnes KR，Faden AI.Role of cell cycle proteins in cns injury.Neurochem Res，2007，32（10）：1799-1807.

10 Nguyen MD，Mushynski WE，Julien JP.Cycling at the interface between neurodevelopment and neurodegeneration.Cell Death Differ，2002，9（12）：1294-1306.