Midkine反義寡聚脫氧核苷酸對糖尿病腎病大鼠腎臟CTGF表達水平的影響

王俊偉，張麗梅，楊 慧，苑記清，任曉軍，馮 憑

（1.天津醫科大學總醫院代謝病科，天津300052；2.天津醫科大學解剖學教研室，天津 300070）

近年研究表明炎癥因子在糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）的進展中起到至關重要的作用，其中結締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF）是促進腎臟纖維化的重要炎癥因子，另有最新研究發現[1]基因敲除中期因子（midkine,MK）的小鼠能顯著改善DN的進展。MK是一種肝素結合細胞因子，具有趨化炎癥細胞，抗損傷和抗細胞凋亡等功能。既往對MK的研究僅局限于腫瘤、神經系統及炎癥性疾病，但在DN中的作用少有報道，MK與CTGF是否存在聯系尚不明確。本研究通過反義寡聚脫氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleortides,AS-ODNs）技術抑制MK的合成，觀察MK對早期DN大鼠腎臟CTGF表達水平的影響，探討MK ASODNs在早期DN中的治療前景。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用8周齡、雄性清潔級SD大鼠，體重（197±18）g，購自中國醫學科學院放射醫學研究所，飼養于天津醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗材料 鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；全程硫代磷酸化修飾的MKAS-ODNs購自上海生工生物公司，序列如下5′-AGGGCGAGAAGGAAGAAG-3′[2]；RNA離心柱型試劑盒購自北京百泰克公司；逆轉錄試劑盒購自北京全式金公司；RealtimePCRMasterMix（SYBRGreen）購自大連寶生物公司；實時熒光定量PCR引物購自北京奧科鼎盛公司。

1.3 方法 雄性清潔級SD大鼠適應性飼養1周后完全隨機法分為正常組、DN組和MKAS-ODNs組各20只。DN組和MKAS-ODNs組均行單側腎臟切除術，高糖高脂飼料飼養4周，隨后尾靜脈注射STZ 30mg/kg；正常組行切皮假手術，普通飼料飼養4周，尾靜脈注射檸檬酸緩沖液30mg/kg。注射STZ1周采用葡萄糖氧化酶法連續監測3d隨機血糖均≥16.7mmol/L作為糖尿病造模成功的標準。分別于成模后第0、3、6周監測飲水量、尿量、體重及24h尿微量白蛋白的變化，成模第6周末，MKAS-ODNs組尾靜脈注射MKAS-ODNs1mg/kg[2]，正常組和DN組予等量生理鹽水，干預4d后留取24h尿及腎臟組織待測。

1.4 實時熒光定量PCR 離心柱法提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用SYBRGreen嵌合熒光技術進行實時熒光定量 PCR。引物：MK-up:5′-TTCTAGCCCTTGTTGCCTTCTT-3′;MK-down:5′-ACCCATGCCGCATCCTT-3′；CTGF-up:5′-CGGGAAATGCTGTGAGGA-3′；CTGF-down：5′-TCTGGACCAG GCAGTGG-3′；GAPDH-up：5′-GTCGGTGTGAACGGATTT-3′；GAPDH-down:5′-ACTCCACGACGTAC TCAGC-3′。反應條件：預變性：95.0 ℃ 3min；變性：95.0 ℃ 10s；退火：56.7 ℃ 10s；延伸：72.0 ℃ 20s；39個循環；每個樣本重復3遍。儀器自動生成CT值，GAPDH作為內參基因對樣本進行校對，然后對不同組樣本間的目的基因表達量進行比較，采用2-△CT 法計算。

1.5 統計學方法 數據應用統計分析軟件SPSS 18.0處理，采用均數±標準差表示，組間均數比較采用單因數方差分析（ANOVA），組內兩兩比較采用LSD，Dunnett’s法，并進行 speraman 相關分析。統計學顯著性檢驗水平α=0.05（雙側）。

2 結果

2.1 一般指標 成模后DN組和MKAS-ODNs組大鼠逐漸出現多飲、多尿、體重下降，毛發枯黃，精神體力差等糖尿病癥狀。于第6周開始出現24h尿微量白蛋白升高且與正常組比較差異有統計學意義，此時糖尿病大鼠處于早期DN階段。處死后DN組和MKAS-ODNs組大鼠腎臟體積增大，重量增加，髓質部分空虛，測腎重體重比值較正常組明顯增加，進一步證明糖尿病大鼠處于早期DN階段（表1）。

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周時的相關指標變化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周時的相關指標變化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

3周417.56±75.33 396.08±52.24 410.69±65.58 1.010 0.398 0周358.17±60.96 434.75±37.84 424.15±47.12 6.663 0.001 0周35.17±10.34 34.65±35.85 24.15±27.12 6.663 0.001 6周494.67±78.87 409.67±56.50 462.91±72.44 4.812 0.006 3周28.67±14.58 152.50±86.96 110.00±67.55 5.673 0.002 6周56.67±88.24 227.90±101.48 119.10±90.07 9.937 0.000 0周0.11±0.04 0.12±0.05 0.15±0.02 0.95 0.960 3周0.09±0.03 1.36±1.49 1.79±1.96 1.010 0.398 6周1.90±1.03 16.61±12.56 17.32±2.85 4.812 0.006體重/kg 尿量/mL 24h尿微量白蛋白/(mmol/L) 腎重體重比值2.6±0.23 8.5±1.43 7.56±0.63 2.562 0.021 n組別20 20 20正常組DN組MKAS-ODNs組FP

2.2 實時熒光定量PCR結果 DN組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達水平較正常組明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；MKAS-ODNs組大鼠腎臟組織中MK和CTGF的表達水平較DN組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）（表 2）。

表2 各組MK和CTGF表達水平的比較Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

表2 各組MK和CTGF表達水平的比較Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

與正常組比較#P<0.05；與DN組比較*P<0.05，**P<0.01

組別正常組DN組MKAS-ODNs組FP CTGF/（×103）0.74±0.54 216.14±143.98#0.31±0.23**16.98 0.000 MK/（×103）0.23±0.13 235.95±165.01#0.48±0.29*12.35 0.000 n 10 10 10

2.3 MK和CTGF在DN大鼠腎臟組織表達的相關性 MK和CTGF在DN大鼠腎臟組織的表達有直線相關關系，且為正相關（r=0.498，P<0.05）。

3 討論

炎癥因子與糖尿病腎病的進展密切相關，其中CTGF不僅是促進腎小管上皮細胞間質化的重要因子，還對細胞外基質的產生、積聚起重要作用[3]，是促進DN進展的重要細胞因子。既往有研究發現CTGFAS-ODNs可以有效地抑制大鼠腎間質纖維化，抑制腎小管上皮細胞間質化[4]。但是CTGF在體內多個臟器均表達，若應用反義寡聚脫氧核苷酸抑制CTGF的表達必定會影響其他臟器，而MK在成年組織中僅于腎臟和小腸表達，其他部位幾乎不表達[5-6]。最新研究發現MK的表達水平和DN的進展呈正相關[7]，但MK與CTGF的相關性尚不明確。本研究通過反義寡聚脫氧核苷酸技術抑制MK的表達，發現減少MK合成可以有效地抑制CTGF的表達。

目前，反義寡聚脫氧核苷酸技術已經被廣泛應用。本研究將MK作為反義治療的靶點，首先考慮到MK基因生理情況下的表達特點：MK在胚胎上皮-間葉組織和神經組織中呈高表達，出生后MK基因的表達逐漸降低；在成年組織中，除腎臟和小腸上皮外其他部位幾乎不表達。因此，筆者認為將MK作為治療的靶點所導致的副作用最小。其次，有文獻報道MK AS-ODNs在尾靜脈注射后可快速地被大鼠近端小管選擇性攝取并整合到近端腎小管上皮細胞中[8]，近端小管上皮細胞通過刷狀緣膜ODNs結合蛋白的活動可以不衰減地有效地攝取ODNs[9-11]，本研究證實早期DN大鼠腎臟組織中MK的表達水平明顯高于正常組，當予MK AS-ODNs干預4 d后MK的合成較DN組明顯減少，說明通過尾靜脈注射的方法可以成功地將MK AS-ODNs導入腎臟組織并發揮作用，與國外報道一致。

本研究發現MK和CTGF的表達水平呈正相關，CTGF在早期DN大鼠腎臟組織中的表達水平隨著MK表達的減少而減少，說明MK AS-ODNs通過抑制MK的合成，可以降低早期DN大鼠腎臟組織CTGF的表達水平，從而阻斷腎間質纖維化的進程、抵抗腎間質損傷，對于早期DN具有治療潛能。

總之，尾靜脈注射MK AS-ODNs可以降低早期DN大鼠腎臟組織MK和CTGF的表達水平，減緩腎間質纖維化進程且安全性高、副作用小。因此，我們認為MK AS-ODNs有望成為治療DN的新靶點。

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