超聲波衍生化-高效液相色譜法測定水中草甘膦

馬 進(jìn)，張 偉，陳 鍔

（甘肅省環(huán)境監(jiān)測中心站，甘肅 蘭州 730020）

草甘膦，化學(xué)名稱為N-（膦酰基甲基）甘氨酸，純品是白色固體，極性強(qiáng)，是一種有機(jī)酸，且不溶于有機(jī)溶劑的一種水溶性除草劑[1-3]。草甘膦的內(nèi)吸傳導(dǎo)性和廣譜的殺滅效果非常強(qiáng)[4]，世界上許多國家在大量地使用，致使水資源污染，植物損害，威脅到了人類和動物的健康[5-8]，如草甘膦對動物骨髓細(xì)胞有明顯致突變作用[6]和遺傳毒性[7]，對人體的皮膚、呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)等都有影響。因而對草甘膦的檢測具有非常重要的意義。草甘膦的檢測方法有離子色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[9-11]。實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用柱前超聲波衍生化[12]對水中草甘膦進(jìn)行測定，優(yōu)化超聲波衍生的條件和衍生副產(chǎn)物凈化萃取劑的選擇，建立了操作較為簡單，對前處理儀器要求低，精密度和準(zhǔn)確度良好的高效液相色譜法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器和試劑

液相色譜儀，型號1200，配備FLD檢測器，Agilent公司；色譜柱：Agilent Eclispe XDB-C18（15μm，150 mm×4.6 μm）；KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)）；電子天平（精度0.1 mg）

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液（Reagecon公司，Ireland），1000 μg/mL；甲醇、乙腈、二氯甲烷均為色譜純；十水合四硼酸鈉（優(yōu)級純，天津光復(fù)）；磷酸（優(yōu)級純，天津科密歐）；9-芴甲酯氯甲酸酯（優(yōu)級純，北京伊諾凱）；濾膜（0.45 μm,聚四氟乙烯，津騰）；二水合檸檬酸三鈉（分析純，天津光復(fù)）。

1.2 液相條件

色譜柱：Agilent Eclispe XDB-C18（0.5μm，150×4.6 mm）；

流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.2%磷酸溶液，乙腈；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：30 ℃；

進(jìn)樣量：20 μL；

檢測器：FLD，激發(fā)波長：254 nm，發(fā)射波長：302 nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)使用液

用100 μL微量進(jìn)樣針準(zhǔn)確移取草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/mL）100 μL于10 mL容量瓶中，用純水定容至10 mL刻度，使用液濃度為10 μg/mL。

1.3.2 工作曲線繪制

分別準(zhǔn)確移取草甘膦標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 μg/mL）5 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL到10 mL容量瓶中，用純水定容至刻線，其濃度分別為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、200 μg/L、500 μg/L。分別取各濃度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL于10 mL的聚乙烯塑料管中，加入1.0 mL 9-芴甲酯氯甲酸酯乙腈溶液，0.5 mL四硼酸鈉溶液混勻，置于超聲波清洗器45 ℃下衍生50 min，加入5.0 mL二氯甲烷超聲萃取凈化10 min,靜止分層，取水相層1.0 mL，過0.45 μm濾膜后上機(jī)檢測。以草甘膦濃度為橫坐標(biāo)（x），相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（y），制作工作曲線。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.3.3 樣品測定

量取10 ml水樣，加入0.029 3 g二水合檸檬酸三鈉，經(jīng)過預(yù)先用甲醇和水活化好的十八烷基硅膠（500 mg/6 ml）固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，取凈化后的樣品2.00 mL加入1.0 mL 9-芴甲酯氯甲酸酯乙腈溶液，0.5 mL四硼酸鈉溶液混勻，進(jìn)行超聲衍生、萃取凈化后取上層水相1.0 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 草甘膦定性分析

用AgilentEclispeXDB-C18（0.5 μm，150×4.6 mm）色譜柱在熒光檢測器下，選擇激發(fā)波長為230 nm，發(fā)射波長為302 nm測定草甘膦，目標(biāo)化合物響應(yīng)高，分離度好，見圖1。

圖1 草甘膦標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

2.2 草甘膦線性范圍和檢出限

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，草甘膦在5～500 μg/L的線性范圍內(nèi)，回歸方程為y=0.472 8x+0.508 2，相關(guān)系數(shù)R=0.999 4，能夠滿足定量檢測要求。工作曲線見圖2。

圖2 草甘膦標(biāo)準(zhǔn)曲線

當(dāng)取2.0 mL凈化后的空白樣品（加標(biāo)量為10 μg/L），根據(jù)上述方法重復(fù)測定7次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S，依據(jù)公式MDL=S×t（n-1，0.99）計(jì)算檢出限，得到檢出限為1 μg/L,檢出下線為4 μg/L，能夠滿足生活污水、工業(yè)廢水、地表水和地下水的檢測要求。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

取地下水樣品，加標(biāo)濃度為10 μg/L、100 μg/L和500 μg/L的低、中、高三個(gè)濃度點(diǎn)，按照上述實(shí)驗(yàn)過程，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 精確度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

由表1 可知，加標(biāo)量在10～500μg/L范圍內(nèi)，回收率為81.8%～96.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.91%～3.58%，其準(zhǔn)確度高，精密度良好。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 溫度和衍生化時(shí)間

取2.0 mL草甘膦標(biāo)液，依據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行前處理后，在25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃五種水浴溫度條件下，分別用超聲衍生30 min、40 min、50 min、60 min、70 min,用二氯甲烷萃取，過0.45 μm濾膜后上機(jī)分析，結(jié)果見圖3。

圖3 衍生溫度和時(shí)間影響

由圖3可知，衍生溫度和時(shí)間影響草甘膦衍生產(chǎn)物的響應(yīng)值，低溫下，衍生化反應(yīng)不完全，造成測定時(shí)響應(yīng)過低；高溫下，衍生化產(chǎn)物會出現(xiàn)分解現(xiàn)象，使得測定時(shí)響應(yīng)降低；隨著衍生反應(yīng)時(shí)間的延長能夠看出，衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)值也隨時(shí)間增大，在50 min時(shí)達(dá)到峰值，持續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間，響應(yīng)值會有所下降。所以，在溫度為45 ℃，超聲衍生時(shí)間為50 min時(shí)，草甘膦與9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液發(fā)生衍生化的效果最好，響應(yīng)值最高。

2.4.2 衍生化副產(chǎn)物的凈化

當(dāng)草甘膦與9-芴甲基氯甲酸酯發(fā)生反應(yīng)生成草甘膦衍生物的同時(shí)，會產(chǎn)生副產(chǎn)物，在測定時(shí)，液相色譜上會出現(xiàn)一個(gè)很大的峰，影響草甘膦的測定，所以在測定之前要對水樣中的副產(chǎn)物進(jìn)行凈化。

本方法選取三氯甲烷、正己烷和二氯甲烷對衍生過后的樣品進(jìn)行超聲萃取凈化，通過對比凈化效果，可知二氯甲烷的凈化效果最好。

3 結(jié)論

通過超聲波衍生化-高效液相色譜法測定水中草甘膦的實(shí)驗(yàn)表明：衍生溫度為45 ℃，衍生時(shí)間為50 min，衍生產(chǎn)物用二氯甲烷超聲萃取凈化時(shí)，草甘膦的衍生產(chǎn)物分離度好，出峰時(shí)間早，衍生副產(chǎn)物去除效果較佳。此外，該方法在草甘膦加標(biāo)濃度為10～500 μg/L范圍內(nèi)，平均回收率為81.8%～96.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.91%～3.58%。本實(shí)驗(yàn)精密度和準(zhǔn)確度良好，并且操作較為簡便，檢出限較低，可以滿足地下水、地表水、污水、工業(yè)廢水中草甘膦的檢測要求。