山西野生卷丹百合鱗莖組織培養

馬素嫻，田志強，亢秀萍

（山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

卷丹百合（Lilium lanclfolium）又名虎皮百合，為百合科百合屬多年生球根類花卉，鱗莖卵圓形至扁球形、黃白色，地下莖易生小鱗莖，地上莖多生珠芽[1]。其在我國各地均有野生分布，具有較高的觀賞、食用和藥用價值[2]。卷丹百合一般采用小鱗莖分球繁殖和珠芽繁殖，但長期營養繁殖容易造成種性退化[3-4]。

通過組織培養技術，能在短期內更新品種，生產脫毒苗，具有較高的經濟價值和開發潛力。目前，國內對百合栽培種的組織培養較多[5-6]，而對適應性極廣的野生種自然三倍體卷丹的研究甚少。

本研究以野生卷丹百合鱗莖鱗片為外植體，以MS為基礎培養基，研究不同激素配比及添加不同質量濃度蔗糖的培養基對卷丹百合不定芽、愈傷組織及不定芽生根的誘導效果，旨在為今后野生卷丹百合大規模繁殖及生產提供理論依據與技術指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

野生卷丹百合鱗莖于2011年10月采集自山西省蘆芽山自然保護區。該區地理位置為：東經 111°56′07 ″，北緯 38°45′23″，海拔為2 600 m。鱗莖于5℃低溫冰箱中保存。試驗中，初代培養材料為內層、中層、外層鱗莖鱗片，各處理數均為20。小芽繼代培養，每個處理以20個長勢均一的小芽為材料；愈傷組織繼代培養，每個處理為20個長勢均一的愈傷顆粒。

1.2 試驗方法

將卷丹百合鱗莖用自來水沖洗干凈，并用手術刀把鱗莖分成外、中、內3部分（外圍2～3層鱗片為外部鱗片，中心較嫩的2～3層為內部鱗片，其余為中部鱗片），剔除腐爛的鱗片，用流水沖洗3～4 h，先用75%酒精表面滅菌30 s，無菌水沖洗2次；再在0.1%氯化汞溶液中進行滅菌，用無菌水沖洗5次。

滅菌后將每片鱗片切成0.2 cm×0.2 cm切塊，接種到添加有不同激素的MS培養基上，其中蔗糖3%，瓊脂0.68%，pH值為5.8。培養條件為：光照強度 2 000 lx，培養溫度（25±1）℃[7]。

1.3 數據分析

試驗數據采用Microsoft Excel和SAS軟件進行統計與分析。

小芽直徑增加百分率＝（繼代培養后平均直徑－繼代培養前平均直徑）/繼代培養前平均直徑×100%；愈傷組織質量增加百分率＝（繼代培養后平均鮮質量－繼代培養前平均鮮質量）/繼代培養前平均鮮質量×100%；生根率＝生根小鱗莖數/總小鱗莖數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同激素對鱗莖鱗片的誘導

將滅菌完成后的卷丹百合鱗莖鱗片切去鱗莖盤并產生切口，接種到含有不同植物激素濃度的培養基上。5 d后，外層鱗片首先變綠，其次中層鱗片變綠，內層鱗片最后變綠。12 d后鱗片切口處出現白色芽點，19 d后芽點逐漸轉為綠色并開始膨大。33 d后芽點膨大為小芽，50 d后統計每個處理中內層、中層、外層鱗莖鱗片小芽數和產生愈傷組織的鱗莖鱗片數。試驗結果及方差分析如表1所示。

表1 不同激素對鱗莖鱗片芽點的誘導情況

由表1可知，NAA和6-BA對鱗莖鱗片芽點及愈傷組織的誘導影響均顯著。當NAA質量濃度與6-BA質量濃度比值介于1/20～1/10之間時，分化為芽點能力較高，且最佳誘導激素組合為NAA 0.1 mg/L，6-BA 2.0 mg/L；當 NAA質量濃度與6-BA質量濃度比值介于1/5～1/2之間時，分化為愈傷組織能力較高，且最佳誘導激素組合為NAA0.2 mg/L，6-BA1.5 mg/L。由表1還可知，鱗莖鱗片的分化能力內層、中層、外層依次增加。

2.2 不同質量濃度蔗糖對繼代培養的影響

芽點逐漸膨大為小芽后，由于母體營養耗盡，其生長速度下降。為了保持小芽繼續膨大為小鱗莖的生長速度，將其與母體材料分離，選擇大小均一的小鱗莖轉接到MS培養基上，通過改變蔗糖質量濃度，觀察小鱗莖生長和愈傷組織生長量的變化。由于培養基在60 d后可能出現失水等退化現象，會影響材料吸收營養，因此，繼代培養50 d后，測量并統計繼代小芽和愈傷組織生長量。試驗結果及方差分析如表2所示。

由表2可知，不同質量濃度蔗糖對小芽和愈傷組織繼代培養的生長量影響顯著。由圖1可知，蔗糖質量濃度低時，小芽和愈傷組織的生長速度受到限制；質量濃度達到40 g/L時，愈傷組織生長量達到最大；質量濃度達到50 g/L時，小芽生長量最大，但愈傷組織生長量下降，且發生褐化現象。試驗還發現，隨著蔗糖質量濃度的增加，小芽由綠轉變為紅褐色個數明顯增多；而相同質量濃度下，小芽生長量仍有增加，但增加比率有所下降。因此，繼代培養小芽和愈傷組織時，可選用添加蔗糖40 g/L的MS培養基。

表2 不同質量濃度蔗糖對小芽和愈傷組織繼代培養的影響

2.3 不同質量濃度蔗糖對小鱗莖生根的影響

進行小芽繼代培養10 d后，發現大量小鱗莖膨大，同時底部出現黃色小點；20 d左右可明顯觀察到多條小根，出現生根現象。30 d統計每個小芽生根情況。統計結果及方差分析列于表3。

表3 不同質量濃度蔗糖對小鱗莖生根的影響

由表3可知，隨著蔗糖質量濃度增加（由于能量物質供應充足），小鱗莖生根率和生根數明顯增加。從圖2，3可直觀看出，當蔗糖質量濃度達到40 g/L時，生根率和生根數達到最大；蔗糖質量濃度達50 g/L時，生根率和生根數出現明顯下降，且發生明顯褐化現象。同時，試驗時觀察發現，質量濃度為40 g/L蔗糖下，新生根較添加其他質量濃度的培養基中的粗壯。因此，誘導生根可采用添加蔗糖40 g/L的MS培養基。

2.4 煉苗與移栽

將已生根的小鱗莖幼苗打開瓶蓋煉苗3～7 d后，取出洗去根上的培養基，定植于裝有1/3草炭＋1/3珍珠巖＋1/3河沙混合基質的營養缽內，澆透水，蓋上薄膜，使其保持高溫高濕的環境。其中，草炭可供以根系水分與營養物質；珍珠巖可確保基質內有空氣，利于組培苗成活；河沙可增加基質排水力，提高根系呼吸強度。10 d后，逐漸揭去薄膜，讓組培苗逐漸適應外界環境，緩沖2種環境下苗體的不適反應。30 d后，將營養缽內幼苗移栽至室外，正常管理，使其自然生長。

3 結論與討論

野生卷丹百合在我國分布極廣，抗性強，是少見的三倍體種。本研究表明，誘導鱗莖鱗片不定芽與愈傷組織的最佳培養基，可以通過調節6-BA與NAA不同配比實現；質量濃度為40～50 g/L的蔗糖對不定芽與愈傷組織繼代培養影響較大。同時發現，質量濃度為30～40 g/L的蔗糖對不定芽生根重大意義，生根率高達89.97%。段祖安等[8]對卷丹鱗莖鱗片的誘導培養研究發現，不同質量濃度蔗糖對其分化影響效果不明顯。

試驗中將鱗莖鱗片分為內層、中層、外層鱗片，并觀察記錄整個組織培養生長情況，結果表明，各激素配比培養基中產生不定芽和愈傷組織量情況，都表現為外層＞中層＞內層，說明鱗片由內向外，生長勢趨向增大。郭海濱等[9]對卷丹鱗莖、杭玲等[10]對蘭州百合鱗片的組織培養研究中也得到了相同的結論。此外，將鱗片以內層、中層、外層加以區分，在滅菌過程中施以不同滅菌處理，也會對試驗大有裨益。

通過本試驗，得到野生卷丹百合鱗莖組織培養的有效途徑與影響因素，可為野生三倍體卷丹的低成本生產與快繁提供理論依據和具體措施。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（4卷）[M].北京：科學出版社，2004：152.

[2]山西省植物志編輯委員會.山西植物志（5卷）[M].北京：中國科學技術出版社，2004：167-188.

[3]李謀智.食用百合組織培養快繁技術研究 [J].北方園藝，2006（1）：101-102．

[4]邵小斌，周翔，徐艷，等.野生百合：卷丹的組織培養初探[J].天津農業科學，2010，16（4）：18-19.

[5]陳貴華，石嶺，吳玉峰.卷丹百合組織培養研究[J].內蒙古農業大學學報，2009（12）：61-64.

[6]樊蘭瑛，高宏樟，郭常蓮.東方百合組培快繁試驗[J].山西農業科學，2008，36（9）：29-32.

[7]趙強，李慶典，趙玉嶺.青島百合的組織培養技術研究[J].北方園藝，2007（6）：213-214.

[8]段祖安，王洪利，趙艷燕，等.卷丹百合組培快繁技術的研究[J].山東農業大學學報：自然科學版，2009，40（4）：495-497.

[9]郭海濱，雷家軍.卷丹百合鱗片及珠芽組織培養研究[J].中國農學通報，2006（2）：72-74.

[10]杭玲，蘇賓，陳立新，等.龍牙百合組培快繁技術研究[J].廣西農業科學，2001（4）：183-184.