光敏色素基因與作物改良利用

馬燕斌，吳 霞，王 霞 ,2，韓青龍 ，張相斌 ，段曉康 ，李燕娥

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；3.山西省農(nóng)業(yè)廳，山西太原030001）

目前，經(jīng)過遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、育種學(xué)等相關(guān)研究領(lǐng)域的交叉及深入研究，研究人員已經(jīng)能夠較系統(tǒng)地在基因組水平對植物進(jìn)行改良，并取得了較好的研究進(jìn)展。在國內(nèi)研究單位中，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所是把基因功能研究、生物技術(shù)改良與作物遺傳育種相結(jié)合的綜合性科研單位。多年來，經(jīng)過科研人員的不斷努力，已經(jīng)選育出和正在選育的棉花及其他作物的新品種與新種質(zhì)資源在逐年增加。在這一背景下，筆者以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所多年來在抗逆、抗蟲、抗除草劑以及農(nóng)藝性狀改良等方面的相關(guān)研究為參考，主要介紹了目前以光敏色素基因?yàn)橹鞯难芯窟M(jìn)展，并探討利用其進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新的可行性。

1 光敏色素結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在植物生長發(fā)育過程中，光照除提供能量外，還可以通過植物光信號傳遞途徑來調(diào)控植物的生長發(fā)育。這一調(diào)控既包括對種子萌發(fā)、幼苗去黃化、葉片開張、莖稈伸長、開花期等的直觀調(diào)控，也包括向地性、向光性、避陰性、氣孔開張、葉綠體運(yùn)動等微觀調(diào)控。在這類光信號受體基因中，紅光和遠(yuǎn)紅光的光信號受體主要是光敏色素基因。

光敏色素家族存在 PHYA，PHYB，PHYC，PHYD和PHYE共5個(gè)不同的成員，但在玉米、水稻以及小麥等單子葉植物中，僅有PHYA，PHYB和PHYC這3類光敏色素[1-2]。利用擬南芥、水稻、大豆、小麥等植物的光敏色素基因與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所生技室根據(jù)NCBI登錄序列為參考克隆的玉米光敏色素基因編碼的氨基酸序列比較分析可知，在這些植物中，光敏色素分子的基本結(jié)構(gòu)均由N端和C端2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成（圖1），它們之間由一個(gè)鉸鏈區(qū)（flexible hinge region）連接[3]。其中，N 端由 GAF結(jié)構(gòu)域、PHY結(jié)構(gòu)域組成，大約為70 kDa，主要功能為結(jié)合發(fā)色團(tuán)、光吸收和光轉(zhuǎn)換等。而C端由1個(gè)與組氨酸激酶相關(guān)的結(jié)構(gòu)域（HISKinase-like ATPase）和2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，大約為55 kDa，其PAS亞結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白互作平臺[3-4]。

2 光敏色素的生物學(xué)特征

擬南芥中，光敏色素基因均能在根、莖和花中表達(dá)，并受環(huán)境、發(fā)育以及特定組織的信號調(diào)節(jié)，但蛋白的含量和穩(wěn)定性存在明顯差異[5-6]。因此，根據(jù)在不同光條件下的穩(wěn)定性，光敏色素被分為光不穩(wěn)定型和光穩(wěn)定型2類。第1類，PHYA為光不穩(wěn)定型，其基因轉(zhuǎn)錄的表達(dá)模式存在差異[5-7]。第 2類，PHYB，PHYC，PHYD和 PHYE 為光穩(wěn)定型[8]。其中，PHYB在低比率的紅光/遠(yuǎn)紅光（R/FR）信號感知中具有主要作用[9]。由于低比率的R/FR表明附近存在其他植物或樹陰存在，且葉綠體吸收的是紅光而非遠(yuǎn)紅光，這樣就會引起對光吸收等各種競爭性的生長反應(yīng)，導(dǎo)致莖和葉柄的伸長、提前繁殖等[10]。此外，光敏色素還存在紅光吸收型（Pr）和遠(yuǎn)紅光吸收型（Pfr）2種活性形式[11]。

3 光敏色素基因控制的農(nóng)藝性狀

光敏色素基因也是一類調(diào)控重要農(nóng)藝性狀的基因，極有利于改良作物的株高、產(chǎn)量等有利性狀。目前，有研究表明，轉(zhuǎn)光敏色素基因的番茄、煙草、馬鈴薯和水稻均表現(xiàn)為植株降低、光合效率增強(qiáng)和產(chǎn)量提高。在煙草、燕麥中過量表達(dá)PHYA時(shí)，植株表型矮化，且與赤霉素減少有關(guān)，在莖和葉柄的微管組織中能夠檢測到高濃度的燕麥PHYA，表明微管組織是PHYA作用的一個(gè)可能位點(diǎn)[12]。通過對水稻的phyA突變體功能研究也證實(shí)，突變體在黑暗條件下的表型與在持續(xù)的遠(yuǎn)紅光條件下的表型一致[13]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，光敏色素家族共同控制水稻節(jié)間伸長[14]。此外，Weller等[15]利用豌豆PHYA基因的功能獲得性突變體（PHYA蛋白N端保守氨基酸Ala被替換）研究證實(shí)，其蛋白進(jìn)行光轉(zhuǎn)化后的命運(yùn)與PHYA光受體分子的N端區(qū)域有很大關(guān)系。

4 光敏色素的細(xì)胞定位研究

研究證實(shí)，帶有GUS或綠色熒光蛋白標(biāo)簽的PHYA和PHYB蛋白能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并且在細(xì)胞核內(nèi)形成核內(nèi)小體（NBs）[16-17]。且PHYA：GFP向核內(nèi)運(yùn)輸和NBs的形成是非常快速的，通過水稻的PHYA：GFP在煙草中表達(dá)和擬南芥中PHYA：GFP的研究發(fā)現(xiàn)，在受光照15 min之內(nèi)，PHYA就快速轉(zhuǎn)移到核內(nèi)[18-19]。

PHYB：GFP在黃化苗中是定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或核內(nèi)，但是，只有持續(xù)的紅光能夠有效誘導(dǎo)PHYB：GFP的累積和色斑形成[20-21]。而在光敏色素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面研究證明，光受體PHYA降解是通過具有E3連接酶的功能COP1蛋白作用的，并且導(dǎo)致PHYA信號傳導(dǎo)減弱[22-23]，以及通過介導(dǎo)CO蛋白的磷酸化影響隱花色素對開花的調(diào)節(jié)等[24]。此外，還有一個(gè)關(guān)鍵因子PIF4與不同光調(diào)控的啟動子上的G-box DNA序列結(jié)合，并與PHYB一起調(diào)節(jié)氣孔發(fā)育[25-26]。而PHYC：GFP和PHYE：GFP受白光誘導(dǎo)后可以在核內(nèi)形成亮點(diǎn)[27]。目前，控制光敏色素定位的NLS（nuclear localization signal）和 NES（nuclear export signal）的機(jī)制還不清楚。

5 其他基因的克隆

近年來，結(jié)合山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所的發(fā)展及研究需要，通過分子標(biāo)記、基因克隆、基因功能研究以及生物技術(shù)改良等手段，在基因功能、棉花育種以及轉(zhuǎn)基因?qū)ν寥牢⑸镉绊懙确矫孢M(jìn)行了較多的研究[28-30]。目前，利用山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所培育的棉花、小麥等在育種方面具有極大利用價(jià)值的作物材料，除光敏色素基因外，還逐步克隆了與耐鹽、耐旱等相關(guān)的多個(gè)基因，在棉花、玉米等作物中開展探索性基礎(chǔ)研究，通過在RNA、蛋白水平進(jìn)行基因功能研究，并利用其進(jìn)行作物轉(zhuǎn)基因種質(zhì)創(chuàng)新等，為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所在應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面打下了良好的基礎(chǔ)，這些研究將有助于推動山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所未來的快速發(fā)展。同時(shí)，對一些在抗逆、農(nóng)藝性狀改良等方面具有明顯生物學(xué)功能的基因，由于其對植物發(fā)育過程影響作用明顯，因而，可以加快利用其進(jìn)行棉花、玉米等作物的改良研究。

6 展望

人類對糧食增加的需求是作物改良的最大推動力，而作物產(chǎn)量的不斷提高需要有新的技術(shù)與理論支持。在當(dāng)前，除利用遺傳育種手段進(jìn)行育種外，利用外源基因進(jìn)行棉花等作物改良，有助于加強(qiáng)我國在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的探索及利用。因此，還需廣大科研工作者不懈努力，宣傳與普及科學(xué)的基因改良技術(shù)，以得到社會的認(rèn)同與支持。

[1]Sharrock R A，Quail P H.Novel phytochrome sequences in Arabidopsis thaliana：structure，evolution,and differential expression of a plant regulatory photoreceptor family[J].Genes Dev，1989，3（11）：1745-1757.

[2]Clack T，Mathews S，Sharrock R A.The phytochrome apoprotein family in Arabidopsis is encoded by five genes:the sequences and expression of PHYD and PHYE[J].Plant Mol Biol，1994，25（3）：413-427.

[3]Rockwell N C，Su Y S.Phytochrome structure and signaling mechanisms[J].Annu RevPlant Biol，2006，57：837-858.

[4]NeffMM，F(xiàn)ankhauser C，ChoryJ.Light:an indicator oftime and place[J].Genes Dev，2000，14（3）：257-271.

[5]Somers DE，Quail P H.Temporal and spatial expression patterns of PHYA and PHYB genes in Arabidopsis[J].Plant J，1995，7（3）：413-427.

[6]Goosey L，Palecanda L，Sharrock R A.Differential patterns of expression of the Arabidopsis PHYB，PHYD，and PHYE phytochrome genes[J].Plant Physiol，1997，115（3）：959-969.

[7]Canton F R，Quail P H.Both phyA and phyB mediate light-imposed repression of PHYA gene expression in Arabidopsis[J].Plant Physiol，1999，121（4）：1207-1216.

[8]Hirschfeld M.Coordination of phytochrome levels in phyB mutants of Arabidopsis as revealed by apoprotein-specific monoclonal antibodies[J].Genetics，1998，149（2）：523-535.

[9]Devlin P F，HallidayK J，Harberd N P，et al.The rosette habit of Arabidopsis thaliana is dependent upon phytochrome action：novel phytochromes control internode elongation and flowering time[J].Plant J，1996，10（6）：1127-1134.

[10]Filiault D L，Wessinger C A.Amino acid polymorphisms in Arabidopsis phytochrome Bcause differential responses tolight[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（8）：3157-3162.

[11]Quail P H，Boylan MT.Phytochromes：photosensory perception and signal transduction[J].Science，1995，268：675-680.

[12]Jordan E T，Hatfield P M.Phytochrome A overexpression in transgenic tobacco.Correlation of dwarf phenotype with high concentrations ofphytochrome in vascular tissue and attenuated gibberellin levels[J].Plant Physiol，1995，107（3）：797-805.

[13]Takano M，Kanegae H，Shinomura T，et al.Isolation and characterization of rice phytochrome A mutants[J].Plant Cell，2001，13（3）：521-534.

[14]Iwamoto M，Kiyota S，Hanada A，et al.The multiple contributions of phytochromes to the control of internode elongation in rice[J].Plant Physiol，2011，157（3）：1187-1195.

[15]Weller J L，Batge S L，Smith J J，et al.A dominant mutation in the pea PHYA gene confers enhanced responses to light and impairs the light-dependent degradation of phytochrome A[J].Plant Physiol，2004，135（4）：2186-2195.

[16]Sakamoto K，Nagatani A.Nuclear localization activity of phytochrome B[J].Plant J，1996，10（5）：859-868.

[17]Yamaguchi R，Nakamura M.Light-dependent translocation of a phytochrome B-GFP fusion protein tothe nucleus in transgenic Arabidopsis[J].J Cell Biol，1999，145（3）：437-445.

[18]Kircher S，Kozma-Bognar L，Kim L，et al.Light quality-dependent nuclear import of the plant photoreceptors phytochrome Aand B[J].Plant Cell，1999，11（8）：1445-1456.

[19]Kim L.Light-induced nuclear import of phytochrome-A：GFP fusion proteins is differentially regulated in transgenic tobacco and Arabidopsis[J].Plant J，2000，22（2）：125-133.

[20]Gil P，Kircher S，Adam E，et al.Photocontrol of subcellular partitioning of phytochrome-B:GFP fusion protein in tobacco seedlings[J].Plant J，2000，22（2）：135-145.

[21]Chen M，Schwab R，Chory J.Characterization of the requirements for localization of phytochrome B to nuclear bodies[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（24）：14493-14498.

[22]Matsushita T，Mochizuki N，Nagatani A.Dimers of the N-terminal domain ofphytochrome Bare functional in the nucleus[J].Nature，2003，424：571-574.

[23]Seo H S，Watanabe E，Tokutomi S，et al.Photoreceptor ubiquitination byCOP1 E3 ligase desensitizes phytochrome A signaling[J].Genes Dev，2004，18（6）：617-622.

[24]Liu L J，Zhang Y C，Li Q H，et al.COP1-mediated ubiquitination of CONSTANS is implicated in cryptochrome regulation of floweringin Arabidopsis[J].Plant Cell，2008，20（2）：292-306.

[25]Huq E.SRL1：a newlocus specific tothe phyB-signalingpathwayin Arabidopsis[J].Plant J，2000，23（4）：461-470.

[26]Casson S A，F(xiàn)ranklin K A，Gray J E，et al.phytochrome B and PIF4 regulate stomatal development in response tolight quantity[J].Curr Biol，2009，19（3）：229-234.

[27]Kircher S，Gil P，Kozma-Bognár L，et al.Nucleocytoplasmic partitioning of the plant photoreceptors phytochrome A，B，C，D，and E is regulated differentiallybylight and exhibits a diurnal rhythm[J].Plant Cell，2002，14（7）：1541-1555.

[28]范巧蘭，陳耕，李永山，等.轉(zhuǎn)Bt基因棉花不同生育期對土壤微生物的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（12）：34-36.

[29]上官小霞，吳霞，李燕娥.棉花GhRDL1基因啟動子分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，25（1）：6-10.

[30]張林水，吳霞，杜春芳，等.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉晉棉44號選育研究及高產(chǎn)栽培要點(diǎn)[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（6）：49-52.