果醋發酵液殘留乙醇含量的快速檢測

劉志鵬，楊海麟，夏小樂，張 玲，王 武

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122)

果醋發酵液殘留乙醇含量的快速檢測

劉志鵬，楊海麟，夏小樂，張 玲，王 武*

(江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122)

在康維皿比色法的基礎上，建立了一種快速測定果醋發酵液殘留乙醇的新方法。結果表明:采用康維皿作為反應容器，乙醇反應體系在580nm處具有最大吸收峰。果醋中的乙醇濃度在0.5%～10%(v/v)之間呈良好線性，回歸方程為Y=0.07389X－0.00886，相關系數R2=0.9995。該方法具有取樣量少、快速、準確、無需復雜儀器等優點，不僅適于測定果酒或果醋終產品的乙醇含量，也便于跟蹤果酒或果醋生產過程的乙醇含量動態變化，具有較好的應用推廣價值。

康維皿，快速檢測，殘留乙醇，果醋

發酵型果醋具有軟化血管、解酒保肝、調節體液循環和抗癌養生等功效，被譽為繼碳酸飲料、飲用水、果汁和茶飲料之后的“第四代”飲料，發展空間和市場潛力巨大［1－2］。發酵型果醋經兩階段發酵而成，先經酵母菌發酵為果酒，后由醋酸菌發酵成果醋。果醋發酵液含有果汁中殘留的糖類物質和酵母菌、醋酸菌代謝生成的各類醇類、酚類和有機酸等物質，增加了果醋殘留乙醇含量的檢測難度［3－5］。果醋發酵液中的乙醇含量是果醋釀造過程中的的重要監測指標，是醋酸發酵終止點的重要判斷依據，直接關系著發酵產物的質量及相關發酵參數的計算，美國液態食醋標準(AOAC)規定果醋中殘留乙醇含量需小于0.5%(v/v)［6］。傳統的乙醇測定方法主要有三種:氣相色譜法、密度瓶法和乙醇計法。氣相色譜法精度高，用樣少，速度快，但氣相色譜儀比較昂貴，對操作者的要求以及儀器維護費用都較高，不適用于中小企業應用;密度瓶法和乙醇計法為避免溶液內其他物質對檢測結果的干擾需先將發酵液經過蒸餾等處理后再測定，步驟繁瑣，并且所用樣品量多且花費時間較長，精密度和準確度較差［7－9］，上述方法主要運用在乙醇發酵檢測中，在果醋生產過程中仍欠缺一種快速靈敏的檢測方法。康維皿比色法測乙醇原理基于加熱的乙醇在康維皿封閉環境下從飽和K2CO3環境中逸出與K2Cr2O7在酸性條件下反應生成綠色的Cr2(SO4)3，色澤在一定范圍內與乙醇濃度成正比，通過測定吸光度可確定發酵液中的乙醇含量。該方法操作快捷簡便，樣品純度要求低，檢測成本低廉，能夠快速測定果醋發酵兩個階段的乙醇含量，但該方法目前沒有系統的使用規范，相關涉及文獻很少，并且在檢測液的配制和檢測過程上仍存在一定問題，如缺少精確的顯色液配比，沒有固定的檢測限，缺乏實際果醋發酵檢驗等［10－11］。本工作針對以上問題在原有康維法的基礎上進行了改進，通過精確計算確定了重鉻酸鉀和濃硫酸的添加量，按比例配制重鉻酸鉀－硫酸溶液，保證了顯色液內反應物質的濃度，同時通過對果醋發酵全過程乙醇濃度的檢測驗證了該方法的準確度和對果醋發酵過程的適應性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安琪果酒活性干酵母 安琪公司;滬釀1.01醋酸桿菌(Acetobacter pasteurianus) 本實驗室保藏;濃縮蘋果汁 無錫市橙汁源果汁廠;標準溶液110%(v/v)乙醇溶液;標準溶液2 0.5%～10%(v/v)乙醇溶液;飽和K2CO3溶液 無水K2CO3115g溶于100m L水中，用時取上清液;醋酸菌固體培養基 葡萄糖 10g/L、酵母粉 5g/L、瓊脂粉 20g/L、CaCO320g/L、pH6.5，121℃滅菌20m in冷卻至70℃加入無水乙醇4%，搖勻后分裝試管擺斜面;醋酸菌種子培養基 葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸二氫鈉0.5g/L、硫酸鎂0.5g/L、調pH6.5，121℃滅菌20m in;果醋發酵培養基 果酒發酵出乙醇含量為6%(v/v)左右的果酒;其他試劑 均為分析純，市售。

塑料康維皿 外徑90mm，廣東環凱微生物科技有限公司;LDZX－40Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;9162MBE型恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司;HYL－A型全溫搖床柜 太倉市強樂實驗設備廠;V－1100D型可見分光光度計 上海美譜達有限公司;DHG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥器 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵方法［12］果酒發酵:濃縮蘋果汁稀釋至含糖量120g/L左右;活化后的酵母菌以4‰(v/v)接種量加入果酒發酵培養基中，于25℃恒溫培養3～4d至含糖量降至5g/L時終止發酵。

果醋發酵:醋酸菌經斜面和種子培養基活化后以10%(v/v)接種量加入發酵好的果酒中，于30℃，轉速170 r/m in恒溫搖床振蕩培養2～3d至乙醇濃度降至0.5g/L為發酵終點。

1.2.2 顯色液配比的推導及測定方法 液配比的推導:設濃度為1%(v/v)的乙醇在康維皿中完全揮發并反應完全，所需K2Cr2O7和濃H2SO4量分別為X和Y，則根據配平后反應式可算出反應液中兩物質的添加量，保證反應過程中乙醇充分氧化。

測定方法:a.配制反應液:取K2Cr2O73.4g，加水80m L，充分溶解后緩慢加入濃H2SO42.5m L，冷卻后定容至100m L;b.取康維皿2個，外圈上邊緣均勻涂抹一層甘油，盡量使涂抹的厚度一致;c.外圈的一側加入K2CO3飽和溶液，另一側分別加入蒸餾水和待測液，內圈中加入2m L K2Cr2O7－H2SO4溶液，立即蓋好皿蓋后輕輕轉動康維皿，使乙醇溶液與飽和K2CO3溶液充分混合;d.在80℃恒溫箱中準確保溫30m in后，內圈反應液稀釋4倍，以加入蒸餾水的內圈對照液作為空白對照，在最佳吸收波長下掃描，見圖1。

1.2.3 吸收波長的掃描選擇 將標準溶液1作為待測液，其他方法步驟同1.2.2，在波長530～640nm范圍內進行掃描，以檢測波長為橫坐標，吸光度為縱坐標做圖，取曲線最高點處的波長為檢測波長。

1.2.4 繪制乙醇濃度標準曲線 取8個康維皿涂抹好甘油后，各取不同濃度標準溶液2加入康維皿外圈，其他操作方法同1.2.2，在波長580nm處測定各內圈溶液吸光度，以吸光度為縱坐標，乙醇濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.5 樣品乙醇含量測定方法 無需離心、除菌或蒸餾等操作，直接量取發酵液0.2m L，其他方法步驟同1.2.2，測定各內圈溶液吸光度，將讀出的吸光度值代入標準曲線，即得出發酵液中的乙醇含量。

1.2.6 其他分析方法 糖濃度檢測:DNS比色法;醋酸濃度檢測:酸堿滴定法［13］。

圖1 康維皿比色法示例圖Fig.1 Example diagram of KangWei－Utensil

2 結果與分析

2.1 乙醇反應液最大吸收波長的確定

樣品溶液1經反應后的內圈溶液置于不同的波長下檢測其吸光度，選取最大吸收峰處波長作為樣品檢測波長，實驗結果見圖2。

圖2 標準樣品液1的吸收光譜圖Fig.2 The absorption spectrum of sample 1

由圖2可知，標準溶液1的吸光度A在λ= 580nm處達到最大值，此時波長偏差對應的吸光度偏差最小，被測組分的靈敏度最高，能有效減小實驗誤差，故選取該波長作為康維皿法測定乙醇濃度的測量波長。

2.2 乙醇測定標準曲線的繪制

根據配制的乙醇標準溶液2檢測值擬合出乙醇和λ=580nm處吸光度值的標準曲線回歸方程，結果見圖3。

由圖3可知，乙醇－OD580nm標準曲線的回歸方程在0.5%～1%(v/v)之間呈良好線性，對曲線作回歸分析得相關系數 R2=0.9995，回歸方程式 Y= 0.07389X－0.00886，其中Y表示吸光度，X表示乙醇濃度，0.00886表示補償參數。

2.3 密度及抗其他組分干擾的結果

果醋內含有大量的揮發酸醋酸和少量的糖類、醇類和有機酸等物質，為確保測定數據的準確性，設計精密度和干擾實驗。在果醋發酵過程前期和后期各取5個樣，同時采用氣相色譜法測定乙醇含量，并將結果與原康維皿比色法檢測結果進行分析比對，結果見表1;在標準溶液1中分別加入各類糖、醇類物質，并檢測乙醇濃度，將測定結果與空白對照進行對比，結果見表2。

從表1結果可知，原康維皿比色法由于缺少精確的顯色液配比和固定的檢測限，造成檢測結果與實際值偏差較大;改進康維皿比色法測定結果標準偏差較小，對不同發酵樣品測定數據可靠。從檢測成本角度考慮，康維皿可重復多次使用，并且對樣品前處理和儀器要求小，可以短時間大批量檢測。

由表2結果可知，額外添加醋酸等干擾物質并不影響乙醇含量的測定，與空白對照相比，檢測結果波動均在誤差范圍之內，使用康維皿能夠有效避免發酵液中各類糖類、醇類物質對檢測結果的影響。

表1 康維皿比色法和氣相色譜法檢測結果Table 1 Result of KangWei－Utensil and GC

表2 抗干擾度實驗結果Table 2 Result of anti－interference degrees

圖3 乙醇濃度標準曲線Fig.3 Standard curve of alcohol

2.4 回收率實驗

準確量取無水乙醇5m L，用果醋樣品溶液定容至100m L，進行回收實驗，平行五次，測得結果計算回收率，一般回收率在95%～105%之間，結果見表3。

2.5 果酒及果醋發酵過程乙醇含量的快速檢測

通過上述研究，初步建立了一種乙醇快速檢測方法，將其應用于果醋檢測中，分別對果醋發酵兩階段乙醇含量進行在線即時檢測，并同時分別測定糖濃度和產酸強度，以計算生產強度和轉化率，從而驗證該檢測方法對果醋生產適用性。果酒發酵及乙醇生成速率見圖4、圖5，果醋發酵及乙醇消耗速率見圖6、圖7。為便于表示，乙醇濃度均以質量分數表示，換算關系為1%(v/v)=0.8g/dL。

表3 回收率實驗結果Table 3 Result of recovery test

圖4 果酒發酵過程Fig.4 Fermentation process of cider

圖5 糖消耗率及乙醇生產速率Fig.5 Spending rate of sugar and production rate of alcohol

由圖4結果可知，在果酒發酵階段除發酵前期和后期由于菌體活力不足造成產醇速率較慢，糖度的下降與乙醇濃度的上升趨勢相同，發酵80h后糖濃度下降至5g/L時，接近發酵終點時，生成的乙醇濃度為5.3g/dL。由圖5可知，在發酵過程中，單位時間糖的消耗量與乙醇生成量基本相同，轉化率維持在46%左右，終轉化率為45.6%。康維皿檢測法能夠準確反映出果酒發酵過程中的乙醇生成情況，檢測結果不受果酒發酵液復雜體系中糖類、醇類物質變化的影響，從而能夠有效的指導生產。

圖6 果醋發酵過程Fig.6 Fermentation process of vinegar

圖7 乙醇消耗速率及醋酸生產速率Fig.7 Spending rate of alcohol and production rate of acetic acid

由圖6、圖7結果可知，果醋發酵時，每消耗1g/dL乙醇生成的醋酸量約為1g/dL，發酵52h時乙醇濃度降至0.5g/dL以下，此時酸度為4.92g/dL，終轉化率為98.4%，生產過程中乙醇－醋酸轉化率約為98%，與實驗值基本相同。此步發酵過程中的乙醇含量亦采用康維皿比色法測定，在更為復雜的果醋發酵液中，數據同樣準確可靠，有效地提高了檢測效率，能夠對果醋發酵整個過程進行即時監測，通過測定發酵過程中殘留乙醇含量了解發酵情況，在發生發酵異常等情況時進行合理調整。

3 結論

果醋釀造以乙醇為底物，生產過程中需要跟蹤分析醇酸的消長關系，以便優化工藝過程。終產品乙醇含量需要準確測定，是判斷發酵是否完全的首要條件。隨著國內果醋市場的逐步開發以及果醋飲料標準的出臺，專門針對果醋相關發酵參數的檢測顯得尤為重要，因此建立快速準確的檢測方法勢在必行［14－15］。

果醋發酵液是由酸類、醇類、醛類、酯類和酚類物質組成的復雜體系［16］，傳統檢測方法易受成分波動而造成測定不準。本文對康維皿比色法測定乙醇進行了一定改進，固定了反應液的配制濃度，通過精密度和抗干擾度等實驗保證了檢測結果精確度。實驗結果表明:采用康維皿作為反應容器，在580nm處測定，乙醇濃度在0.5%～10%(v/v)之間呈良好線性，測定精密度 RSD為0.4248%，平均回收率為100%，重現性良好。并通過果酒發酵和果醋發酵實驗證明該檢測方法的時效性。整個檢測過程不需要精密的檢測儀器，與傳統乙醇檢測方法相比，不僅取樣量少，減少了檢測的工作量，而且不需要過濾蒸餾等前處理操作，受環境影響小，能準確反映出果酒釀造以及醋酸釀造兩階段乙醇含量變化情況，有利于對整個果醋生產過程的監控，為快速測定果醋發酵液殘留乙醇含量提供了一種較為方便、準確的方法，隨著果醋產業的不斷發展，該檢測方法將得到更為廣泛的應用。

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Rapid assay of residue alcohol in the fermentation liquid of fruit vinegar

LIU Zhi－peng，YANG Hai－lin，XIA Xiao－le，ZHANG Ling，WANG W u*
(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

A rap id method was developed for detec ting residue alcohol in fruit vinegar accord ing to KangWei－Utensil colorimetric method p rincip le.The result showed that，the maximum absorbance waveleng th of alcoholwas 580nm using KangWei－Utensilas reac tion container.There was a good linear relationship w ith R2=0.9995 w ithin the range from 0.5%～10%(v/v)，regression equation was Y=0.07389X－0.00886.Due to the advantages of rap id，convenient，and com p lex equipm ent non－required，the m ethod was not only suitab le for detec ting the alcohol content in fruit vinegar，but also tracking the change of alcohol during fermentation p rocess.The method m ight be app lied on other biop rocesses which involving w ith detection of ethanol residue or finalethanol concentration.

KangWei－Utensil;rap id detection;residue alcohol;fruit vinegar

TS255.47

A

1002－0306(2012)12－0079－04

2011－09－30 *通訊聯系人

劉志鵬(1986－)，男，在讀碩士研究生，研究方向:生物工程。

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(JUSRP111A25)。