殼寡糖制備過程中還原糖的全自動電化學測定

李雪梅，史建國，*，鄭 暉，馬耀宏，李秋順

(1.山東省科學院生物研究所，山東濟南 250014; 2.山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014)

殼寡糖制備過程中還原糖的全自動電化學測定

李雪梅1，2，史建國1，2，*，鄭 暉1，馬耀宏1，2，李秋順1

(1.山東省科學院生物研究所，山東濟南 250014; 2.山東省生物傳感器重點實驗室，山東濟南 250014)

采用還原糖電化學分析儀測定殼寡糖制備過程中還原糖的含量。儀器線性范圍0.005%～0.500%氨基葡萄糖，檢測限為0.005%。通過還原糖含量的變化，研究了不同酶促條件如溫度、pH、底物濃度對反應的影響，優化了酶解工藝，并得到酶促反應中還原糖濃度變化與產物聚合度的關系。通過實驗發現，還原糖電化學分析儀適合測定殼寡糖制備過程低濃度還原糖，儀器方法快速、準確、靈敏度高。

殼寡糖，還原糖，電化學測定，酶解

殼寡糖(chitosan oligosaccharide)是殼聚糖降解的產物，不僅具有水溶性好，易吸收等優點，近年來還發現其具有抗腫瘤、抗菌、免疫激活以及保濕吸濕等獨特的生理活性［1－2］，其應用前景倍受矚目。目前制備殼寡糖的方法主要有化學降解法和酶降解法［3－4］，酸解法殼寡糖得率低、水解產物復雜、分離困難，且對環境污染嚴重［5］。酶解法是利用非專一性酶或專一性酶對殼聚糖進行降解的方法，因反應條件溫和而被認為極具工業化生產價值，而選擇何種酶以及酶解條件又成為酶解法制備殼寡糖的關鍵［6］。優化酶解工藝，實現多糖的可控降解，可以提高目標產品收率，降低生產成本。在生產實踐中若能通過研究不同酶解條件下還原糖的濃度變化規律，得到酶解過程還原糖濃度與產物得率的關系，從而優化酶解條件。還原糖作為糖酶解過程中重要的生化指標，其測定方法的快速、準確、便捷顯得尤為重要。目前殼寡糖制備過程還原糖檢測方法常用DNS比色法［7－9］，此方法手工操作較復雜、渾濁，和有不同顏色的樣品有很大的干擾。殼寡糖生產過程中產生還原糖含量較低，常規斐林滴定法、全自動還原糖分析儀［10］等其他方法達不到檢測靈敏度。目前還未見有測定低濃度還原糖的準確、快速的自動化分析技術的報道。本文根據以前的工作基礎［11－12］，研制出了還原糖的自動化測定儀器，用于測定殼寡糖制備過程中低濃度還原糖。提高測定的速度和準確度，降低測試成本。得到還原糖濃度與酶解產物的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

殼聚糖 脫乙酰度＞90%，上海生工;β－葡聚糖酶(β－Glucanase) 諾維信酶制劑公司，活性100FBG/g(真菌β－葡聚糖單位);氨基葡萄糖鹽酸鹽BIO Basic Inc;其它試劑均為分析純。

SGD－4A型還原糖電化學分析儀 山東省科學院生物研究所;KQ－50B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司;Allegra 64R冷凍離心機 美國Beckman公司;HH－6數顯恒溫水浴鍋 金壇市精達儀器制造有限公司;玻碳電極 直徑4mm，天津艾達恒晟科技發展有限公司;Ag/AgCl參比電極 上海辰華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

將不同量的殼聚糖溶解在50m L一定pH的乙酸－乙酸鈉(0.2mol/L)緩沖液中，配制成為反應底物溶液，將此溶液置于20～80℃溫度范圍內，使其與反應溫度達到一致。然后向底物溶液中加入β－葡聚糖酶液5m L，混合均勻，反應一定時間后測定還原糖的濃度。

1.2.1 還原糖濃度測定 還原糖濃度用還原糖電化學分析儀測定:在儲液瓶中加入 0.8%(w/v) K3Fe(CN)6和2.5%NaOH混合溶液。開機后油浴加熱啟動，自動升溫至90℃;自動顯示“準備就緒”，按“運行”鍵，等儀器顯示“定標，請進標樣”，取10μL 0.5%的標準氨基葡萄糖進樣定標，連續定標兩次后，儀器自動提示“測樣，請進樣品”，取酶解液10μL進樣測定，儀器打印測定結果。此結果乘以樣品稀釋倍數即為被測定樣品中還原糖的含量。

每份樣品同時采用DNS(3，5－二硝基水楊酸)法做對照實驗:分別取出一定量的酶解液加入0.2mol/L的乙酸－乙酸鈉緩沖液(pH5.8)補至 2m L，再加1.5m L DNS，沸水浴中反應5m in后，定容至25m L，于520nm測定吸光度。同時，利用氨基葡萄糖鹽酸鹽繪制標準曲線，從而計算酶解產物中還原糖含量。

1.2.2 平均聚合度測定 取1m L酶解液，用還原糖電化學分析儀測定出還原糖的量C0。另取相同溶液1m L，加入3m L 12mol/L鹽酸，沸水浴2h。用適量6mol/L NaOH溶液中和水解液后，用蒸餾水稀釋定容至25m L。取稀釋后的水溶液1m L，同樣用還原糖電化學分析儀測出還原糖量C1。若C0與C1均處于儀器線性范圍之內，則殼寡糖的平均聚合度計算:

式中:n0、n1分別為酸解前和酸解后酶解液的稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 標準品的選擇

殼寡糖是由氨基葡萄糖以β－1，4鍵連接2～10個單元的低聚糖，所以測定殼寡糖制備過程中的還原糖需用氨基葡萄糖做標準。王英瑛等［13］比較了USP法、HPLC衍生化法和紫外分光光度法測定氨基葡萄糖含量的準確性和可靠性。其中，紫外分光光度法采用在碳酸鈉溶液環境下，鐵氰化鉀與氨基葡萄糖反應后在420nm處測定吸收值，在0.2～0.8mg/m L (0.02%～0.08%)內線性關系良好。說明利用氨基葡萄糖與鐵氰化鉀的反應來測定氨基葡萄糖是可行的。

2.2 儀器線性范圍及檢測限

用干燥恒重后的氨基葡萄糖鹽酸鹽配制不同濃度的氨基葡萄糖溶液:0.500%、0.200%、0.100%、0.050%、0.020%、0.010%、0.005%(w/v)。以氨基葡萄糖標準濃度做橫坐標，以測定電流的平均值做縱坐標，得到儀器標準工作曲線(圖1)，即線性范圍。在0.005%～0.500%范圍內線性回歸分析，線性回歸方程為i=5.85+27.27C，相關系數r為0.9999，線性相關性良好。

圖1 氨基葡萄糖溶液的標準工作曲線Fig.1 Standard curve for determination of glucosamine

由表1測定電流的標準偏差(0.042)的3倍與工作曲線斜率(27.27)之比，得最低檢測限為0.005%，即5×10－2mg/m L。

表1 0.100%氨基葡萄糖測定結果Table 1 Measurement results of 0.100%glucosamine

2.3 酶促反應條件的研究

2.3.1 溫度對酶促反應的影響 將0.5g殼聚糖溶解在50m L pH為5.0的乙酸－乙酸鈉(0.2mol/L)緩沖液中，配制成為反應底物溶液，將此溶液置于20～80℃溫度內，使其與反應溫度達到一致。然后在此溶液中加入β－葡聚糖酶5m L混合均勻，在此溫度下反應2h，分別用還原糖電化學分析儀和DNS法測定各個溫度下的還原糖的濃度，結果見圖2。t檢驗，p＞0.05表明兩種分析方法無顯著差異。由此可以看出，當溫度低于25℃時，酶的活性很低。隨著溫度逐漸升高，β－葡聚糖酶的酶活也逐漸升高;當溫度升至45℃時，酶活力升至最高;當溫度升至65℃時酶活迅速下降，最后變性失活。溫度對酶有著雙重影響，一方面升高溫度可以提高反應速率;但另一方面由于酶的本質是蛋白質，隨著溫度的升高，酶會逐漸地變性失活。因此酶的最適溫度是考慮兩方面影響的綜合結果。本實驗選擇酶的最適反應溫度為45℃。

2.3.2 pH對酶促反應的影響 分別取50m L乙酸－乙酸鈉配成的pH為4.0～5.8的緩沖液，在其中加入0.5g殼聚糖，攪拌均勻，加入5m Lβ－葡聚糖酶后置于45℃下反應2h，用還原糖電化學分析儀和DNS法分別測定各pH下還原糖的濃度，結果見圖3。t檢驗，p=0.937(＞0.05)，表明兩種分析方法無顯著差異。由圖3可見，此反應的最適pH為5.0。當pH低于5.0時，尤其是pH在4.0～4.8的時候，反應液的粘度非常大，必然影響酶解的進行，當pH達到5.0時，溶液處于非均相狀態，這使酶與底物的接觸面積大大增加。當pH大于5.0后，雖然粘度降低，但是還原糖濃度也開始下降。pH對β－葡聚糖酶活力的影響主要是因為pH既能影響酶分子功能基團的解離狀態，又能影響殼聚糖分子的溶解性能和分子鏈的舒展狀態。

圖2 溫度對酶促反應的影響Fig.2 Influence of temperature on the enzymatic reaction

圖3 pH對酶促反應的影響Fig.3 Influence of pH on the enzymatic reaction

2.3.3 底物濃度對酶促反應的影響 將不同質量的殼聚糖分別溶解在50m L pH為5.0的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液中，加入5m Lβ－葡聚糖酶，攪拌均勻，在45℃下反應2h，用還原糖電化學分析儀和DNS法分別測定還原糖的濃度，結果見圖4。t檢驗，p=0.635 (＞0.05)，表明兩種分析方法無顯著差異。由圖4顯示，此反應的最適底物濃度為4mg/m L。當底物濃度小于4mg/m L時，隨著底物濃度的增加，還原糖濃度增加;當底物濃度大于4mg/m L時，還原糖的濃度又略微下降。這主要是因為底物濃度高時，單糖和二糖的濃度也有所提高，從而表現出更明顯的產物抑制作用。另外，隨著底物濃度的增加，殼聚糖粘度也不斷升高，使酶分子的擴散和底物分子的傳遞都受到了影響，從而影響了酶的催化性能。

圖4 底物濃度對酶促反應的影響Fig.4 Influence of substrate concentration on enzymatic reaction

2.4 酶促反應中還原糖濃度隨時間的變化及與產物聚合度的關系

根據對溫度、pH和底物濃度對酶促反應影響的分析，確定最適宜的酶促反應條件。稱取2g殼聚糖溶解在500m L，pH為5.0的乙酸－乙酸鈉緩沖溶液中，溫度為45℃，加入β－葡聚糖酶液，在此期間每間隔2h測定一次還原糖濃度，并計算酶促反應過程中的平均聚合度，結果如圖5所示。隨著酶促反應的進行，還原糖的濃度不斷上升，同時殼聚糖的平均聚合度逐漸降低。到了11h以后，還原糖濃度上升的趨勢更為明顯，其原因是此時反應溶液的濃度下降，流動性增大，使酶的作用面積和幾率增大。當酶促反應進行到13h左右時，產物聚合度降到15;當酶促反應進行到15h即可得到聚合度小于10的殼寡糖。

圖5 不同時間還原糖濃度與聚合度的關系Fig.5 Relationship between the reducing sugar concentration and polymerization degree at different times

3 結論

由以上實驗結果可見，用還原糖電化學分析儀檢測還原糖濃度的方法方便快捷、準確，與DNS法的對照數據證明了其可靠性。在酶促反應過程中，通過測定酶解液還原糖濃度可以優化酶解工藝，可控制產物的聚合度。

［1］Jeon Y J，Park P T，Kim S K.Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor［J］.Carbohydrate Polymer，2001，44(1):71－76.

［2］Yamada A，Shibuya N，Kodama O.Induction of phytoalexin formation in suspension－ cultured rice cells by N －acetylchitooligosaccharides［J］ .Bioscience Biotechnology Biochemistry，1993，57(3):405－409.

［3］IIyina A V，Tikhonov V E，Albulov A I，et al.Enzymic preparation of acid－free－water－soluble chitosan［J］.Process Biochemistry，2000，35(6):563－568.

［4］Jeon Y J，Kim SK.Production of chitooligosaccharides using an ultrafiltration membrane reactor and their antibacterial activity［J］.Carbohydrate Polymer，2000，41(2):133－141.

［5］張立彥，曾慶孝.酶法在低聚殼聚糖制備上的研究現狀及展望［J］.湛江海洋大學學報，2000，20(4):72－77.

［6］涂紹勇，楊愛華，梅雙喜，等.酶法降解殼聚糖工藝研究［J］.化學與生物工程，2009，26(12):63－65.

［7］曾嘉，鄭連英.通過酶促反應制備殼寡糖［J］.食品與發酵工業，2002，27(10):1－4.

［8］戴大章，夏黎明，方祥年.殼聚糖的酶法降解［J］.功能高分子學報，2005，18(4):687－691.

［9］孫玉英，張繼泉，王淑軍，等.酶促反應制備殼寡糖條件的研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28(11):67－71.

［10］史建國，楊艷，張利群，等.一種還原糖自動檢測系統［J］.東南大學學報，2003，33(增刊):162－164.

［11］李雪梅，孟慶軍，楊俊慧，等.電化學法測定馬鈴薯全粉中還原糖的含量［J］.食品工業科技，2008，29(11):257－259.

［12］李雪梅，史建國，朱思榮，等.淀粉糖生產過程中還原糖的半自動電化學檢測［J］.食品工業科技，2009，30(12): 388－390.

［13］王英瑛，李俊，曾蘇.氨基葡萄糖3種含量測定方法的比較［J］.中國現代應用藥學雜志，2009，26(4):307－309.

Automatic electrochem ical determ ination of reducing sugar during the preparation of chitosan oligosaccharide

LIXue－mei1，2，SH I Jian－guo1，2，*，ZHENG Hui1，MA Yao－hong1，2，LIQiu－shun1
(1.Biology Institute of Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China; 2.Key Laboratory for Biosensors of Shandong Province，Jinan 250014，China)

Reducing sugar was measured using reducing sugar elec trochem ical analyzer during the p reparation of chitosan oligosaccharide.The linear range of g lucosam ine was from 0.005%to 0.500%，and detec tion lim it was 0.005%.The effec t of d ifferent enzymatic cond itions such as tem perature，pH，substrate concentration on the reaction were researched by changes of reducing sugar content.The enzymatic hyd rolysis p rocess had been op tim ized.The relationship between the deg ree of polym erization of the p roduc t and the reducing sugar concentration was got.Reducing sugar electrochem ical analyzer could determ ine reducing sugar of low concentrations during the p reparation of chitosan oligosaccharide，itwas fast，accurate，high sensitivity.

chitosan oligosaccharide;reducing sugar;electrochem ical determ ination;enzymatic hyd rolysis

TS201.2+3

A

1002－0306(2012)12－0087－04

2011－08－16 *通訊聯系人

李雪梅(1977－)，女，博士，副研究員，研究方向:食品分析、生化分析。

山東省科技攻關項目(S2007GG10002004);山東省自然科學基金(Y2007D54);濟南市青年科技明星計劃(20080121);山東省博士后專項創新基金。