榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化活性研究

王應男，張公亮，劉 洋，張 浩，侯紅漫

(大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034)

榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化活性研究

王應男，張公亮，劉 洋，張 浩，侯紅漫*

(大連工業大學食品學院，遼寧大連 116034)

利用乙醇分級沉淀法獲得50%醇沉榆耳多糖、70%醇沉榆耳多糖及85%醇沉榆耳多糖，比較其抗氧化能力。結果表明:85%醇沉榆耳多糖的還原能力及對DPPH·的清除作用最強。0.5mg/mL 85%醇沉榆耳多糖對DPPH·的清除率達到83.0%，IC50=29.94μg/mL。0.3mg/mL 70%醇沉榆耳多糖對OH·的清除率達到84.3%，IC50=0.124mg/mL。榆耳菌絲體多糖清除超氧陰離子效果不理想，清除率僅為8.6%。榆耳菌絲體多糖具有較高的抗氧化活性。

榆耳，多糖，抗氧化

真菌多糖是從真菌中分離得到的由10個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，在國際上被稱為“生物反應調節劑”，具有抗腫瘤、抗氧化、防衰老、降血脂、調節免疫等多種生物功效［1］。榆耳學名肉紅膠韌革菌，是一種樹木腐生的珍貴食、藥兼用真菌。近年來研究發現，榆耳發酵產物營養豐富，其中榆耳多糖作為榆耳中主要的活性成分，已受到人們的廣泛關注［2］。在人體生命活動中，自由基是各種生化反應的中間代謝產物，化學活性高。若其不能維持在一定的動態平衡時，自由基就會對機體造成不同程度的損傷，使機體加速衰老，嚴重時可能誘發各種疾病。補充含抗氧化劑的營養物質可提高機體清除自由基的能力［3］。榆耳多糖的抗腫瘤、免疫調節、抗炎等多種生物活性已逐漸成為近年來研究熱點［4］，而對其抗氧化性能的研究報道較少。本研究選用榆耳菌絲體作為多糖的來源，利用乙醇分級沉淀法對不同分子量的榆耳菌絲體多糖組分進行抗氧化活性分析，評價其還原能力、對羥基自由基、超氧陰離子、DPPH·自由基的清除能力，尋求榆耳多糖作為天然功能性抗氧化劑的可能，為榆耳的綜合開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

榆耳菌絲體 實驗室搖瓶深層發酵培養技術得到榆耳發酵菌株;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、二苯代苦味?；杂苫?DPPH·) 均為分析純。

SC－3610型低速離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司;UV2102型紫外分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 榆耳菌絲體多糖的制備 發酵菌株→收集菌絲體→冷凍干燥→榆耳菌絲體干粉

按水料比40∶1(V∶W)加入蒸餾水，95℃下熱水浸提8h，4000 r/m in離心15m in。反復提取三次，收集上清液濃縮至總體積的1/5，加入三倍體積乙醇，4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，40℃下烘干。采用Sevag法除蛋白［5］后，對榆耳菌絲體多糖進行乙醇分級沉淀，使乙醇濃度分別達到 50%、70%和85%，離心所得沉淀依次為50%醇沉榆耳多糖GI－Ⅰ、70%醇沉榆耳多糖GI－Ⅱ和85%醇沉榆耳多糖GI－Ⅲ。

表1 榆耳菌絲體分級醇沉多糖還原力測定結果Table 1 The reductive ability of polysaccharides from mycelium of Gloeostrereum incarnatum

表2 榆耳菌絲體分級醇沉多糖對羥基自由基清除作用結果Table 2 Hydroxyl free radical scavenging capability of polysaccharides

1.2.2 還原力的測定 還原力的測定是用來評價抗氧化劑活性的常用方法［6］。取多糖樣品溶液1m L，加入0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)0.2m L和1%鐵氰化鉀溶液 1.5m L，混勻，50℃水浴 20m in。迅速加入10%三氯乙酸溶液1m L，靜置5min，4℃下，3000r/min離心10m in。取上清液3m L，加入3m L蒸餾水及0.1%三氯化鐵溶液0.5m L，混勻，于700nm波長測吸光值。用蒸餾水代替樣品作無還原能力對照，VC作為陽性對照，實驗重復三次。

1.2.3 對羥基自由基清除作用的測定 利用Fenton反應產生的羥基自由基可氧化水楊酸，使水楊酸產生有色物質，在510nm處有強吸收峰。取多糖樣品溶液 1m L，依次加入 9mmol/L FeSO4溶液 1m L、9mmol/L水楊酸－乙醇溶液1m L、8.8mmol/L H2O2溶液1m L，混勻，37℃水浴放置30min。以蒸餾水代替樣品作空白，VC作為陽性對照，510nm下測定吸光值。計算對OH·的清除率。

計算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光度值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

1.2.4 對超氧陰離子清除作用的測定 利用鄰苯三酚在弱堿性介質中會自身氧化分解產生·及有色中間物檢測。

鄰苯三酚自氧化曲線的測定:在兩支具塞試管中分別加入50mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2) 4m L、蒸餾水3m L和3mmol/L鄰苯三酚1m L，25℃恒溫水浴20m in，兩支試管中溶液混勻后立即倒入比色皿，于420nm下每隔20s測定一次吸光值，直到反應啟動后第500s結束。加入多糖樣品后鄰苯三酚自氧化曲線的測定:依上法實驗，以1m L多糖樣品代替1m L蒸餾水，于420nm下測定加入多糖樣品后的鄰苯三酚自氧化曲線。以VC作為陽性對照。

計算公式:

式中，ΔA0:鄰苯三酚的自氧化速率;ΔA:加入多糖樣品后鄰苯三酚的自氧化速率。

1.2.5 對DPPH自由基清除作用的測定 二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)，常用來評估抗氧化物的供氫能力［7］。取多糖樣品溶液 2m L，加入 2m L 0.1mmol/L的DPPH·溶液，迅速混勻后，室溫下避光靜置30m in，在517nm下測定溶液的吸光值，以70%乙醇溶液代替樣品作為空白，VC作為陽性對照，計算其清除率。

計算公式:

式中，A1:加入樣品后的吸光值;A2:樣品本底吸光值;A0:空白吸光值。

2 結果與討論

2.1 還原力的測定

多種抗氧化活性的機制已經被闡明是還原力機制，鏈引發的抑制機制，過渡金屬離子催化劑的折疊機制，過氧化物的分解和自由基清除機理［8］。一種化合物的還原能力可以作為潛在的抗氧化活性的一個重要指標。由表1可知，GI－Ⅲ的還原能力最強，且榆耳分級醇沉所得各組分多糖均具有一定的還原能力，強弱順序為:GI－Ⅲ＞GI－Ⅱ＞GI－Ⅰ。1mg/m L濃度下GI－Ⅲ吸光值達到1.909，其還原能力達到VC的75%，表明榆耳菌絲體多糖中分子量較小組分具有明顯還原能力。如圖1所示，GI－Ⅲ表現出較較強的還原能力，且與VC還原力的變化趨勢基本相同。濃度在0～0.4mg/m L范圍內，吸光值隨濃度的增加顯著增加，當濃度大于0.4mg/m L，吸光值變化不大。根據線性回歸曲線計算可知，濃度為0.060mg/m L的GI－Ⅲ還原能力與0.044mg/m L VC的體系相當。榆耳菌絲體多糖的還原能力說明其能作為一種良好的電子供應者，也能終止自由基鏈的反應，具有一定的抗氧化能力。

圖1 不同濃度85%醇沉榆耳多糖還原力測定Fig.1 The reductive ability of GI－Ⅲin different concentration

2.2 羥基自由基清除作用的測定

由表2可知，榆耳菌絲體分級醇沉多糖對羥基自由基均具有良好的清除作用，其中以70%醇沉榆耳多糖 GI－Ⅱ對羥基自由基的清除能力最強。0.3mg/m L濃度下，GI－Ⅱ對羥基自由基的清除率達到84.3%，GI－Ⅰ對羥基自由基的清除率達到73.4%，均高于VC對羥基自由基的清除率。結果表明，榆耳菌絲體多糖中具有明顯清除羥基自由基能力的為分子量較大的多糖組分。從圖2中可以看出，GI－Ⅱ的濃度與對羥基自由基的清除率呈良好的量效關系，即隨著濃度的增加清除率逐漸升高。當濃度小于0.48mg/m L時，GI－Ⅱ對羥基自由基的清除能力要高于 VC。當其濃度達到 0.48mg/m L時，GI－Ⅱ與VC對OH·清除率相當。根據線性回歸曲線計算得出 VC對羥基自由基清除作用 IC50= 0.265mg/m L，70%醇沉榆耳多糖IC50=0.124mg/m L?？梢娫诘蜐舛确秶鷥龋珿I－Ⅱ表現出明顯的清除羥基自由基的能力，其結果明顯高于茶樹菇多糖、靈芝多糖、香菇多糖等多種食用真菌多糖的清除羥基自由基的能力［9－11］，獲得了又一高抗氧化活性多糖。

表3 榆耳菌絲體分級醇沉多糖對DPPH·清除作用結果Table 3 Scavenging activities of polysaccharides from mycelium of Gloeostrereumincarnatum on DPPH·radical

圖2 不同濃度70%醇沉榆耳多糖對羥基自由基清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging capability of GI－Ⅱin different concentration

2.3 對超氧陰離子清除作用的測定

榆耳多糖各醇沉組分均沒有明顯減緩鄰苯三酚的自氧化現象，而VC對鄰苯三酚的自氧化速率有明顯降低作用，即VC對超氧陰離子有明顯的清除作用，而榆耳菌絲體多糖對超氧陰離子的清除作用較弱，清除率最高時僅達到8.6%。結果表明，榆耳多糖幾乎不能與超氧陰離子發生氧化反應達到清除·的目的。

2.4 對DPPH·自由基清除作用的測定

由表 3可知，榆耳菌絲體多糖中，GI－Ⅲ對DPPH·的清除作用最好。清除能力大小依次為GI－Ⅲ＞GI－Ⅱ＞GI－Ⅰ，與還原能力測定結果一致。其中，0.5mg/m L的GI－Ⅲ對 DPPH·的清除率為83.0%，說明榆耳菌絲體多糖對DPPH·具有較好的清除能力，且分子量較小的組分對DPPH·的清除作用更強。如圖3所示，當VC濃度在0～10μg/m L范圍內，對DPPH·的清除率明顯上升，當其濃度大于10μg/m L時，清除率達到最大且基本保持不變。GI－Ⅲ濃度在0～80μg/m L范圍時，對DPPH·的清除率隨濃度增加明顯上升，當其濃度大于80μg/m L時，其對DPPH·的清除作用趨于平緩。計算可以得出，VC的 IC50=2.63μg/m L，85%醇沉榆耳多糖 IC50= 29.94μg/m L。由此可知，當85%榆耳醇沉多糖在極低的濃度下，對DPPH·就具有很強的清除能力。以上結果說明85%醇沉榆耳多糖對DPPH·的清除作用明顯。

圖3 不同濃度85%醇沉榆耳多糖對DPPH·清除作用Fig.3 Scavenging activities of GI－Ⅲin different concentration on DPPH·

3 結論

本文通過乙醇分級沉淀獲得分子量不同的榆耳多糖組分GI－Ⅰ、GI－Ⅱ、GI－Ⅲ，比較其抗氧化能力。研究表明，GI－Ⅲ的還原能力和對DPPH·自由基的清除作用最強，GI－Ⅱ對羥基自由基的清除率最高。且榆耳菌絲體多糖的抗氧化作用在一定濃度范圍內，呈現出明顯的劑量效應關系。除對超氧陰離子的清除沒有明顯作用以外，與其他真菌多糖相比［12］，榆耳菌絲體多糖表現出較強的抗氧化能力，尤其對羥基自由基的清除能力，以IC50為依據，更是超過了VC的清除能力。

目前對于多糖抗氧化活性作用機理，可能存在如下幾種解釋:a.直接作用于活性氧。b.多糖分子作用于抗氧化酶。c.多糖分子絡合產生活性氧所必需的金屬離子。

本研究確定了榆耳菌絲體多糖的體外抗氧化能力，但對于其作用機理尚不明確，因此，榆耳菌絲體多糖作為一種天然的抗氧化劑，有待于繼續深入研究其抗氧化機理、結構與功能的相關性等，為實現天然抗氧化產品的開發研究奠定基礎。

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Study on antioxidant activities in vitro of polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereumincarnatum

WANG Ying－nan，ZHANG Gong－liang，LIU Yang，ZHANG Hao，HOU Hong－man*
(School of Food，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China)

Using ethanol g rade p recip itation to get three polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereum incarnatum.The frac tions were p recip itated w ith 50%alcohol，70%alcohol and 85%alcohol.Com pare their antioxidant capacity.The results showed that the frac tion p recip itated w ith 85%alcohol p rovided the highest ability of reducing capacity and DPPH· rad ical c lear ability.The DPPH· rad ical c lear ability in concentration of 0.5mg/m LGI－Ⅲwas reach up to 83.0%，IC50=29.94μg/m L.At 0.3mg/m L of the fraction GI－Ⅱof p recip itate w ith 70%alcohol，hyd roxyl rad icals－scavenging activities was 84.3%，IC50=0.124mg/m L.The superoxide radicalsscaveng ing ac tivities of polysaccharides fromGloeostrereumincarnatumwere unideal.The scaveng ing rate was only 8.6%.The polysaccharides from m ycelium ofGloeostrereumincarnatumhad d istinc t antioxidant activity.

Gloeostereuminsarnatum;polysaccharides;antioxidation

TS201.2

A

1002－0306(2012)12－0194－04

2011－09－29 *通訊聯系人

王應男(1986－)，女，碩士，研究方向:珍稀食用菌。