HPLC法測定氟尿嘧啶有關(guān)物質(zhì)的方法研究

徐 飛，閆玉梅，虞 煒

(南通精華制藥股份有限公司，山東南通226006)

氟尿嘧啶為抗代謝抗腫瘤藥物，對結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌有較好的效果，對腎、子宮癌、子宮頸癌和絨毛膜上皮癌有治療前途，動脈滴注可以治療頭頸癌。在現(xiàn)行歐洲、美國、日本和中國等很多藥典中均有收載該品種，且都用到HPLC方法的測試，本文根據(jù)歐洲藥典對氟尿嘧啶有關(guān)物質(zhì)測試的HPLC方法，研究確定其對氟尿嘧啶強迫降解后的雜質(zhì)測試，從而確定該方法對氟尿嘧啶有關(guān)物質(zhì)測試的有效性，取得了滿意效果。

1 儀器與試藥

Waters 515－2487－717高效液相色譜儀，Empower色譜軟件。氟尿嘧啶雜質(zhì)A(巴比妥酸)、氟尿嘧啶雜質(zhì)B(5－羥基尿嘧啶)、氟尿嘧啶雜質(zhì)C(尿嘧啶)、氟尿嘧啶雜質(zhì)D(5－甲氧基尿嘧啶)、氟尿嘧啶雜質(zhì)E(5－氯尿嘧啶)均為本公司購買的對照品，磷酸二氫鉀為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Wakosil－Ⅱ5 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流速:1.0 mL·min－1;檢測波長:266 nm;柱溫:室溫;進樣量:20 μL;流動相:用5 mol·L－1氫氧化鉀溶液將6.805 g·L－1磷酸二氫鉀溶液的 pH 調(diào)至5.7 ±0.1。測定過程避光操作。

2.2 樣品和對照品溶液的制備 供試品溶液:取被測物50.0 mg，加流動相溶解并稀釋至50.0 mL。精密量取該溶液5.0 mL，用流動相稀釋至 50.0 mL。

對照品溶液(a):取氟尿嘧啶雜質(zhì)C對照品5.0mg，用流動相溶解稀釋到50.0 mL。對照品溶液(b):精密量取對照品溶液(a)1.0 mL，用流動相稀釋到100 mL。精密量取該溶液1.0 mL，用流動相稀釋到10.0 mL。對照品溶液(c):取氟尿嘧啶雜質(zhì)A對照品5.0 mg，用流動相溶解稀釋到50.0 mL。精密量取該溶液1.0 mL，用流動相稀釋到100.0 mL。然后再精密量取這個稀釋溶液1.0 mL，用流動相稀釋到10.0 mL。對照品溶液(d):取氟尿嘧啶雜質(zhì)B對照品5.0 mg，用流動相溶解稀釋到50.0 mL。精密量取該溶液1.0 mL，用流動相稀釋到100.0 mL。然后再精密量取這個稀釋溶液1.0 mL，用流動相稀釋到10.0 mL。對照品溶液(e):取供試品溶液1.0 mL，用流動相稀釋到100.0 mL。精密量取該溶液1.0 mL，用流動相稀釋到10.0 mL。對照品溶液(f):將1.0 mL測試液加入到1.0 mL對照液(a)中，用流動相稀釋到10.0 mL。對照品溶液(g)取氟尿嘧啶雜質(zhì)混合物(含雜質(zhì)D、E)的對照品一瓶，溶解于1.0 mL的流動相中。

圖1 雜質(zhì)a圖

圖2 雜質(zhì)b圖

圖3 雜質(zhì)c圖

圖4 雜質(zhì)c和5－FU圖

圖5 雜質(zhì)d和e圖

依次進對照液(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和供試液，各雜質(zhì)相對于5－氟尿嘧啶主峰的相對保留時間:雜質(zhì)A約為0.5，雜質(zhì) B 約為0.7，雜質(zhì) C 約為 0.9，雜質(zhì) D 約為 1.6，雜質(zhì) E 約為 1.9。校正因子:雜質(zhì) D=1.5，雜質(zhì) E=1.3。

2.3 酸堿破壞降解 酸破壞:稱取1.0 g氟尿嘧啶樣品于100 mL 0.1 mol·L－1鹽酸溶液中，加熱回流 8 h 后，放冷，取降解液進樣20 μL檢測雜質(zhì)，堿破壞:稱取1.0 g氟尿嘧啶樣品于100 mL 0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液中，加熱回流8 h，放冷，取降解液進樣20 μL檢測雜質(zhì);另取酸、堿降解液稀釋到一定濃度進行含量測試。結(jié)果顯示氟尿嘧啶在酸中有一定的降解，新增兩個0.1%左右的未知雜質(zhì)，其余雜質(zhì)無明顯變化，在堿中有明顯降解，含量有明顯降低，增加一個0.5%左右的雜質(zhì)，降解后雜質(zhì)都能檢測出，且通過PDA檢測器對主峰和雜質(zhì)峰進行峰純度檢查，結(jié)果表明降解雜質(zhì)及主峰均無其他未檢查到的雜峰包裹。

2.4 高溫破壞降解 將一定的供試品置稱量瓶攤成≤5 mm厚的薄層，開口于100℃溫度下放置5 d，然后將樣品配制成一定濃度進行雜質(zhì)和含量測試，結(jié)果表明高溫5 d后樣品含量下降約2.5%，新增另2個約0.01%的未知雜質(zhì)，原有雜質(zhì)無變化。

2.5 高溫高濕破壞降解 將一定量的供試品放容量瓶中開口置80℃ 75%溫濕度條件下，放置12 d，然后進行雜質(zhì)和含量測試，結(jié)果表明在此條件放置12 d后降解出3個未知雜質(zhì)，原有雜質(zhì)無變化，含量降低了2%。

2.6 光照破壞降解 將一定量的供試品開口放置在照度為(4 500±500)Lx的光照裝置內(nèi)10 d，然后將樣品配制成一定濃度進行雜質(zhì)和含量測試，結(jié)果顯示雜質(zhì)A和B均發(fā)生降解不存在了，雜質(zhì)D無明顯變化，總雜質(zhì)略微降低，含量無明顯變化。

2.7 氧化破壞降解 將一定量的供試品置1% ～3%濃度的過氧化氫30℃溫度放置24 h后，然后吸取一定量稀釋后進行雜質(zhì)和含量測試，結(jié)果表明雜質(zhì)A發(fā)生降解不存在了，雜質(zhì)B、D無明顯變化，有一個未知雜質(zhì)出現(xiàn)，總雜質(zhì)無明顯變化，含量下降約2%。

2.8 各雜質(zhì)的檢出限和定量限 將3倍左右于基線噪聲峰高的濃度確定為檢出限，10倍左右于基線噪聲峰高的濃度確定為定量限，配制各雜質(zhì)合適的濃度進行測試，雜質(zhì)A(巴比妥酸)的檢出限為 1 ng·mL－1、定量限為 1.5 ng·mL－1，氟尿嘧啶雜質(zhì)B(5－羥基尿嘧啶)的檢出限為10 ng·mL－1、定量限為20 ng·mL－1，氟尿嘧啶雜質(zhì)C(尿嘧啶)的檢出限為10 ng·mL－1、定量限為 30 ng·mL－1，氟尿嘧啶雜質(zhì) D(5 －甲氧基尿嘧啶)的檢出限為8 ng·mL－1、定量限為20 ng·mL－1，氟尿嘧啶雜質(zhì)E(5－氯尿嘧啶)的檢出限為10 ng·mL－1、定量限為 20 ng·mL－1，氟尿嘧啶的檢出限為 0.25 ng·mL－1、定量限為 5 ng·mL－1。

3 討論

在選定的色譜條件下，將氟尿嘧啶樣品進行酸、堿、高溫、高溫高濕、光照、氧化等破壞降解后進行測試，結(jié)果表明氟尿嘧啶在這幾個條件下具有不同程度的降解，都能將雜質(zhì)進行很好的分離，且通過PDA檢測器進行峰純度測試表明沒有峰包裹的情況，都能完全檢查各峰。所以該色譜方法對于氟尿嘧啶的有關(guān)物質(zhì)檢測有效可行，能有效檢測出樣品中的各降解物質(zhì)。