不同來源蛋白酶水解對大豆分離蛋白分散性及溶解性的影響

王 一，曾茂茂，何志勇，黃小林，陳 潔，*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122;2.益海－嘉里集團食品技術研究所，河北秦皇島 066206)

不同來源蛋白酶水解對大豆分離蛋白分散性及溶解性的影響

王 一1，曾茂茂1，何志勇1，黃小林2，陳 潔1，*

(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122;2.益海－嘉里集團食品技術研究所，河北秦皇島 066206)

研究了動物(胰蛋白酶)、植物(木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶)、微生物(堿性蛋白酶和中性蛋白酶)三種來源蛋白酶的低限度水解對大豆分離蛋白(SPI)分散性和溶解性的影響。結果表明，三種來源蛋白酶輕度水解可顯著提高SPI的分散性，但卻使其溶解性有不同程度的降低。三種來源蛋白酶水解產物的分散度大小依次為:植物來源蛋白酶＞微生物來源蛋白酶＞動物來源蛋白酶，而其溶解性則相反:動物來源蛋白酶＞微生物來源蛋白酶＞植物來源蛋白酶。本文對采用酶解的方法制備高分散性與高溶解性SPI具有一定的參考價值。通過對木瓜蛋白酶水解沉淀物進行分析，可以推測酶解使SPI溶解度顯著下降的原因可能是SPI被水解后通過疏水作用力和氫鍵相互聚集形成了不溶性的沉淀。

大豆分離蛋白，分散性，溶解性，蛋白酶

酶解技術是工業上用于改性大豆分離蛋白(SPI)的常用手段。關于酶解改性SPI的研究很多，如 Qi［1］等采用胰蛋白酶水解 SPI(DH ＞7)，可以提高其在pH4.5和7.0的溶解性;Lamsal［2］等采用菠蘿蛋白酶對SPI進行低限度酶解，可以使其溶解度顯著提高;高安全［3］等采用中性復合蛋白酶對SPI進行輕度水解，產物溶解度有顯著提高;華欲飛［4］等對過渡態大豆蛋白進行酶解，得到一種制備低凝膠性高分散性大豆蛋白的方法;張艷［5］等采用堿性蛋白酶低限度酶解可以改善大豆濃縮蛋白的分散性。這些研究多采用單一來源蛋白酶對大豆蛋白進行水解，研究酶對于產物溶解性或者分散性的影響;而且現有研究結果顯示，酶解大豆蛋白通常很難使產物溶解性和分散性同時得到提高。由于不同研究人員采用的底物蛋白大多采用商業SPI，而這些商業化原料由于原料的不同以及加工工藝不同，導致酶解結果很難比較。因此迄今為止，單獨從文獻角度很難比較不同來源的蛋白酶對大豆蛋白的溶解性和分散性影響效應，也很難直接利用酶解技術來生產同時擁有高分散性和高溶解性的大豆蛋白產品。事實上，國內飲料工業、功能食品工業、冰淇淋以及相關工業對于高分散和高溶解性的SPI的需求很大，而現實中，高分散性的SPI產品通常溶解度不夠，而高溶解度的SPI產品通常分散性不夠好。基于大豆蛋白工業和研究的現狀，采用包括動物(胰蛋白酶)、微生物(堿性蛋白酶與中性蛋白酶)、植物(木瓜蛋白酶與菠蘿蛋白酶)三種來源的蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，每種蛋白酶選擇3個水解梯度，控制水解度在2%以下，系統地研究了不同來源蛋白酶低限度水解對大豆分離蛋白分散性和溶解性的影響，以期為工業上采用酶解方法生產高分散性和高溶解性大豆分離蛋白提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粉 秦皇島金海食品工業有限公司，粉碎后過80目篩，水分8.36%、蛋白質56.91%;胰蛋白酶(8AU/g) 上海林葉生物科技有限公司;堿性蛋白酶(3AU/g) 無錫聯合恒洲化工有限公司;木瓜蛋白酶(60萬U/g) 廣州市眾緣生物科技有限公司;中性蛋白酶(10萬U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責任公司;菠蘿蛋白酶(1700GDU/g)

廣州市眾緣生物科技有限公司;其它化學試劑均為分析純，國藥集團化學技術有限公司。

RO10P磁力攪拌器、20.n機械攪拌器 廣州儀科實驗儀器有限公司;K10加熱制冷循環器 德國HAAKE公司;HH－4數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司;Avanti J－26 XP高速離心機

美國 BECKMAN公司;DELTA 320型酸度計、JB5374－91電子天平 梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司;QZ－5高速離心噴霧干燥機 錫山市林洲干燥機廠;AH－BASIC高壓均質機 ATS工業系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白的提取 低溫脫脂豆粕與水1∶8(m∶v)混合，用3mol/L的NaOH調節pH 為7.8，40℃下攪拌1h，然后10000×g離心10min后取上清液。用3mol/L的鹽酸溶液調節上清液pH到4.5，室溫攪拌10min，10000×g離心10min后取沉淀。將沉淀加水復溶，配制成6%的大豆分離蛋白儲備液。將儲備液進行酶解處理后，再用3mol/L的NaOH調節pH到7.0，采用高壓均質機20MPa均質三次后，進行噴霧干燥，最后得到SPI。

1.2.2 酶解 將1.2.1中的大豆分離蛋白儲備液，用3mol/L的鹽酸或3mol/L的NaOH調節pH到7.0，分別加入胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶五種蛋白酶在不同溫度下進行水解(如表1所示)，反應30min后，沸水浴15min滅酶。在反應過程中用pH－stat法［6］測定水解度。每種蛋白酶做3個不同的酶底比(酶的質量與溶液中蛋白質量的比值)，以得到3個不同的水解度。

1.2.3 分散度的測定 分別測定60s分散度和20s分散度兩個值，以判斷產物在水中的分散能力。

60s分散度:提前準備去離子水30mL于100mL燒杯中，打開攪拌器，保持轉速恒定在500r/min，稱取0.5g SPI快速倒入燒杯，同時按下秒表，攪拌60s后，關閉攪拌器，迅速將懸浮液倒入60目濾網過濾，測定濾液中蛋白含量。分散度表示為濾液中蛋白質含量與總蛋白質含量的比值［7－8］。濾液中蛋白質含量與總蛋白質含量均采用微量凱氏定氮法［9］測定。

20s分散度:與測定60s分散度的步驟一致，但攪拌時間為20s。

1.2.4 溶解度的測定 在100mL燒杯中倒入30mL去離子水，然后取0.5g SPI，在500r/min下攪拌1h，10000×g離心20min后取上清液，采用微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量。溶解度表示為上清液中蛋白質含量與總蛋白質含量的比值［10］。

1.2.5 木瓜蛋白酶水解沉淀物的分析 按照1.2.2中反應條件，用0.1%的木瓜蛋白酶對大豆分離蛋白進行水解，將滅酶后的水解液10000×g離心10min，取出沉淀后冷凍干燥，得到蛋白粉，采用微量凱氏定氮法測定蛋白粉的蛋白質含量。參考Chawla［11］的方法并稍作改進。取0.2g蛋白粉，分別溶入4mL不同的緩沖液:S1為20mmol/L pH8.0 Tris－HCl緩沖液;S2為含有1%(w/v)SDS的20mmol/L pH8.0 Tris－HCl緩沖液;S3為含有1%(w/v)SDS和8mol/L尿素的20mmol/L pH8.0 Tris－HCl緩沖液;S4為含有 1%(w/v)SDS、8mol/L尿素和 2%(v/v)β－ME的20 mmol/L pH 8.0 Tris－HCl緩沖液。在40℃水浴鍋中靜置4h，每隔10min振蕩1次，10000×g離心10min后取上清液，加入1mL 50%的TCA溶液，4℃靜置18h，使上清液中的蛋白充分沉淀。將沉淀取出，用10%的TCA溶液洗2次，洗完后10000×g離心10min。將最終得到的沉淀溶解于5mL 0.5mol/L的NaOH中，采用雙縮脲法［12］測定蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶水解對水解度的影響

胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別來源于動物、微生物和植物，均是食品工業中常用的蛋白酶。5種蛋白酶采用不同的酶底比對大豆蛋白進行水解，得到不同的水解度，結果如表1所示。過度的水解會使埋藏在長肽鏈結構內部的疏水性氨基酸大量暴露而導致苦味的產生［5］，通過控制酶底比使水解度的范圍在0.5%～1.6%之間，有效地防止了苦味的產生。

2.2 酶解對SPI分散度的影響

采用三種不同來源的蛋白酶對大豆分離蛋白進行不同程度的水解，對得到的蛋白樣品60s和20s分散度進行測定，結果如圖1所示。植物來源的蛋白酶水解后產物的分散性最高，其中加入0.2%(w/w)和0.5%(w/w)菠蘿蛋白酶的樣品分散度在20s和60s內均能達到94%以上，加入0.1%(w/w)木瓜蛋白酶的樣品20s內分散度則在90%左右;加入微生物來源的堿性蛋白酶和中性蛋白酶的樣品，20s和60s的分散度比加植物來源蛋白酶低，但高于動物來源蛋白酶。

2.3 酶解對SPI溶解度的影響

圖1 酶解對SPI分散度的影響Fig.1 The influence of enzymes hydrolysis on the dispersibility of SPI

采用三種不同來源的蛋白酶對大豆分離蛋白進行不同程度的水解，對得到的蛋白樣品的溶解度進行測定，結果如圖2所示。未經處理的大豆蛋白溶解度在90%以上，而經過沸水浴15min熱處理后，其溶解度下降到80%以下，這主要是由于100℃的熱處理能夠使大豆蛋白完全變性，促進蛋白分子相互作用形成不溶性的聚集體［13］。就三種不同來源的蛋白酶而言，動物來源與微生物來源的蛋白酶水解產物的溶解度明顯高于植物來源蛋白酶。胰蛋白酶水解產物的溶解度較高，均在80%以上;堿性蛋白酶水解產物的溶解度也在75%以上，而中性蛋白酶，在加酶量為0.05%(w/w)時，溶解度較差，這可能是由于此時蛋白水解程度較低，而加熱產生了較多的不溶性聚集［13］，隨著加酶量的增加，溶解度逐漸升高，這是由于酶解使肽鍵斷裂形成較多的可溶性多肽和小分子物質，親水性增加［14］;木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解產物的溶解度均有顯著下降。

表1 五種蛋白酶在不同酶底比下的水解度Table 1 Degree of hydrolysis of five enzymes with different enzyme/substrate ratio

2.4 木瓜蛋白酶水解沉淀物的分析

圖2 酶解對SPI溶解度的影響Fig.2 The influence of enzymes hydrolysis on the solubility of SPI

Fuke［15］等采用菠蘿蛋白酶水解大豆蛋白，發現有較多的不溶性沉淀產生，而沉淀可以完全溶于SDS溶液，所以他推測非共價鍵特別是疏水作用力促使了沉淀的產生;Nagai［16］等采用枯草菌溶素水解SPI，發現肽鏈通過疏水作用力結合產生了不溶性沉淀。為探索木瓜蛋白酶水解使SPI溶解度顯著下降的原因，對其酶解產生的沉淀進行分析，結果如表2所示。SDS可以破壞蛋白質分子間的疏水作用力［16］，沉淀在SDS緩沖液中的溶解度比在Tris－HCl緩沖液中有所提高，但提高幅度不大，所以單獨的疏水作用力并不是沉淀產生的主因;SDS和8mol/L尿素共同作用，可以破壞疏水作用力和氫鍵［12］，沉淀基本可以完全溶解，這說明疏水作用力和氫鍵是沉淀產生的主因;含有SDS、尿素和β－巰基乙醇緩沖液，可以打斷二硫鍵和非共價鍵，沉淀溶解度相對SDS和尿素緩沖液沒有明顯提高，這說明二硫鍵并不是沉淀產生的主因。可以推測酶解使SPI溶解度顯著下降的原因可能是SPI被水解后通過疏水作用力和氫鍵相互聚集形成了不溶性的沉淀。

表2 木瓜蛋白酶沉淀在不同緩沖液中的溶解度Table 2 The solubility of SPI aggregate induced by papain hydrolysis with different buffer solution

3 結論

本文研究了動物、植物和微生物三種來源蛋白酶的低限度水解對大豆分離蛋白的分散性和溶解性的影響。結果表明，酶解產物的分散性有顯著提高，但是溶解性相對于未加熱處理的空白樣品均有不同程度的下降，其中植物來源的木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解產物的分散性最好，但是溶解性也最差;而動物來源和微生物來源的胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶水解產物的分散性不如植物來源的蛋白酶，但溶解性顯著高于植物來源蛋白酶。通過對木瓜蛋白酶水解沉淀物進行分析，可以推測酶解使SPI溶解度顯著下降的原因可能是SPI被水解后通過疏水作用力和氫鍵相互聚集形成了不溶性的沉淀。

［1］Qi M，Hettiarachchy N S，Kalapathy U.Solubility and emulsifyingproperties ofsoy protein isolates modified by pancreatin［J］.JournalofFood Science，1997，62(6):1110－1115.

［2］Lamsal B P，Jung S，Jonson L A.Rheological properties of soy protein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis［J］.Food Science and Technology，2007，40(7):1215－1223.

［3］高安全，姬學亮，張二琴.大豆蛋白酶法改性研究［J］.開封大學學報，2004，18(3):92－95.

［4］華欲飛，龍禎，逯昕，等.一種酶改性制備低凝膠性高分散性大豆蛋白的方法:中國，101077119A［P］.2007－11－28.

［5］張艷，華欲飛，孔祥珍.低限度酶水解對醇法大豆濃縮蛋白分散性的影響［J］.食品工業科技，2008，29(10):68－71.

［6］Adler－Nissen J.Enzymatic hydrolysis of food proteins［M］.London and New York:Elsevier Applied Science Publishers，1986:9－24.

［7］Mol J J.Dispersibility and wettability of instant dried milk［J］.Progress report of Group E2.International Dairy Federation.E －Doc.90，Paris.1978.

［8］Jinapong N，Suphantharika M，Jamnong P.Production of instant soymilk powders by ultrafiltration，spray drying and fluidized bed agglomeration［J］.Journal of Food Engineering，2008，84(2):194－205.

［9］GB/T 5009.5－2003，食品中蛋白質的測定［S］.

［10］Jiang J，Chen J，Xiong Y L.Structural and emulsifying properties of soy protein isolate subjected to acid and alkaline pH－shifting processes［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(16):7576－7583.

［11］Chawla S P，Venugopal V，Nair P M.Gelation of proteins from washed muscle of threadfin bream(nemipterus japonicus)under mild acidic conditions［J］.Journal of Food Science，1996，61(2):362－367.

［12］Gornall A G，Bardawill C J，David M M.Determination of serum protein by means of the biuret reaction［J］.Journal of Food Chemistry，1949，177:751－766.

［13］Orgentini D A，Wagner J R，AnonM C.Effects of thermal treatment of soy protein isolate on the characteristics and structruefunction relationship of soluble and insoluble fractions［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1995，43:2471－2479.

［14］王鏡巖，朱圣庚，徐長法，等.生物化學［M］.北京:高等教育出版社，2006:233－234.

［15］Fuke Y，Sekiguchi M，Matsuoka H.Nature of stem bromelain treatments on the aggregation and gelation of soybean proteins［J］.Journal of Food Science，1985，50(5):1283－1288.

［16］Nagai K，Inouye K.Insights into the reaction mechanism of the coagulation of soy protein isolates induced by subtilisin carlsberg［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52(15):4921－4927.

Effect of hydrolysis by various proteases on the dispersibility and solubility of soy protein isolate

WANG Yi1，ZENG Mao－mao1，HE Zhi－yong1，HUANG Xiao－lin2，CHEN Jie1，*
(1.Institute State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.Food Technology Research Institute，Yihai Kerry Oils ＆ Grains Group，Qinhuangdao 066206，China)

Soy protein isolate(SPI)was slightly hydrolyzed by animal protease(pancreatin)，plant proteases(papain＆ bromelin)and microbe－proteases(alcalase ＆ neutral proteinase)respectively，and the effect of hydrolysis on the dispersibility and solubility of SPI was systematically investigated.The results showed that the slight hydrolysis could improve the dispersibility obviously，while decrease the solubility significantly.As for the dispersibility，the three kinds of enzymes could be ranked according to the arrangement from high to low as follow:plant proteases＞microbe－proteases＞animal protease;and as for the solubility，the order was reversed.This study would have some reference value for preparing SPI with high dispersibility and solubility through enzymolysis.The results from the solubility of the insoluble fractions caused by papain hydrolyzation in the different solvents suggested that the hydrophobic area in the soy protein was exposed and promoted the forming of the precipitation.

soy protein isolate;dispersibility;solubility;protease

TS201.1

A

1002－0306(2012)17－0067－04

2012－02－13 *通訊聯系人

王一(1987－)，男，碩士，研究方向:食品蛋白質功能。

973計劃前期研究專項(2010CB535014);高等學校博士學科點專項科研基金資助課題(20100093120005);中央高校基本科研業務費專項資金(JUSRP21108);益海－嘉里集團食品技術研究所項目。