納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ－聚谷氨酸

朱 丹，鄒水洋，*，康建雄

(1.東莞理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞 523808;2.華中科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430074)

納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ－聚谷氨酸

朱 丹1，鄒水洋1，*，康建雄2

(1.東莞理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東東莞 523808;2.華中科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430074)

對納豆芽孢桿菌CICC 20643液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)γ－聚谷氨酸(γ－PGA)的工藝進(jìn)行了研究。采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)獲得了生產(chǎn)γ－PGA的優(yōu)化培養(yǎng)條件:蔗糖25g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸鈉40g/L，裝液量70mL/250mL錐形瓶，起始pH6.5，菌種在37℃、120r/min培養(yǎng)24h后，于培養(yǎng)基中添加5%NaCl，繼續(xù)培養(yǎng)24h，γ－PGA的產(chǎn)量達(dá)到18.04g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:納豆芽孢桿菌CICC 20643是一株產(chǎn)γ－PGA優(yōu)良菌種，在發(fā)酵過程中添加NaCl的工藝能明顯提高γ－PGA的產(chǎn)量。

納豆芽孢桿菌，γ－聚谷氨酸，液態(tài)發(fā)酵，氯化鈉，谷氨酸

γ－聚谷氨酸(poly γ－glutamic acid，γ－PGA)是由L－谷氨酸或D－谷氨酸通過γ－酰胺鍵結(jié)合形成的一種水溶性的生物高分子材料。由于γ－PGA具有吸水性、可降解性、水解性等眾多特性，因此被廣泛用于醫(yī)藥、食品加工、農(nóng)業(yè)、綠化以及水處理等多種領(lǐng)域，具有極大的開發(fā)價值和應(yīng)用前景［1－3］。γ－聚谷氨酸最初發(fā)現(xiàn)是作為炭疽芽孢桿菌莢膜的一種主要成分而存在，后來人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種芽孢桿菌都能在胞外產(chǎn)生 γ－PGA［4］。由于枯草(納豆)芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［5－6］、地 衣 芽 孢 桿 菌 (Bacillus Licheniformis)［7－8］的易培育性和安全性，現(xiàn)在聚谷氨酸的生產(chǎn)大多報(bào)道由此類菌株產(chǎn)生。盡管許多研究者對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ－PGA進(jìn)行了大量研究，但產(chǎn)率普遍處于較低水平，生產(chǎn)成本高，這在很大程度上限制了γ－PGA的工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用。由于γ－PGA生物合成的機(jī)理至今尚不很清楚，而且菌株生成γ－PGA的代謝途徑復(fù)雜，調(diào)節(jié)方式多樣，目前提高其生產(chǎn)效率的方法主要依靠選育優(yōu)良菌種和優(yōu)化發(fā)酵工藝。本文擬對一株產(chǎn) γ－PGA的納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)的液態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，為其工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌(B.subtilis natto)CICC 20643 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC);豆芽汁 市售大豆芽0.5kg，加水2.5kg，煮沸，濃縮至1000mL，過濾待用;斜面培養(yǎng)基 豆芽汁 100mL，蔗糖5g，瓊脂1.5～2.0g，自然pH;種子培養(yǎng)基 蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 蛋白胨10g/L，葡萄糖25g/L，谷氨酸鈉30g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，pH7.0;以上試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

LDZX－40KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HQL300B柜式恒溫冷凍搖床 武漢中科科儀公司;Spectrumlap20可見光分光光度計(jì) 上海凌光技術(shù)有限公司;SPX－250型生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;TDL－5－A多管離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;LDZX－40KB立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠;FA2104電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 菌種培養(yǎng) 菌種在斜面培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)2d，冷藏備用。種子液培養(yǎng):取一環(huán)斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中(250mL錐形瓶裝液量50mL)，在恒溫?fù)u床上37℃、120r/min培養(yǎng)24h。

1.2.1.2 γ－PGA的生產(chǎn) 250mL錐形瓶裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按2%接種量接入種子液，37℃、120r/min搖瓶培養(yǎng)48h，測定培養(yǎng)物的生物量和γ－PGA產(chǎn)量。在考察碳源、氮源的影響時，僅改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源種類，即分別以25g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、檸檬酸、甘油做碳源，以10g/L酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉、草酸銨做氮源進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。在考察谷氨酸鈉濃度、裝液量、起始pH對發(fā)酵的影響時，僅就該因素的水平做相應(yīng)變化，其他組成參照基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵過程中添加NaCl的方法:將菌種前培養(yǎng)0～36h后在培養(yǎng)基中添加5%NaCl(固體顆粒經(jīng)滅菌后按無菌操作方式加入)，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。以上實(shí)驗(yàn)均平行做3個樣品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

1.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 以蔗糖、酵母膏、谷氨酸鈉和裝液量作為考察對象，設(shè)計(jì)了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)方案，影響因素、水平見表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 生物量的測定 將發(fā)酵液稀釋25倍后用可見分光光度計(jì)測定660nm下的吸光值A(chǔ)660［9］。

1.2.3.2 γ－PGA產(chǎn)量的測定 將發(fā)酵液于5000r/min下離心25min，上清液用1mol/L鹽酸調(diào)pH到3.0，加入4倍體積的95%乙醇，放于4℃下冰箱內(nèi)過夜。然后于5000r/min下離心20min，用乙醇洗滌、收集粘性沉淀物，干燥得粗品稱重。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

考察了多種碳源對γ－PGA產(chǎn)量和生物量的影響，結(jié)果如表2所示。常用的一些糖類碳源的表現(xiàn)均比檸檬酸和甘油要好，其中以蔗糖作碳源時的生物量與γ－PGA產(chǎn)量都最高，因此選擇蔗糖作為碳源。有文獻(xiàn)報(bào)道以檸檬酸和甘油作為碳源能促進(jìn)地衣芽孢桿菌 γ－PGA 的合成［7－8］，但對于本實(shí)驗(yàn)菌種來說，以檸檬酸和甘油為碳源時生物量和γ－PGA產(chǎn)量均很低，這可能是菌種不同的原因。

表2 不同碳源對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響Table 2 Effects of various carbon sources on yield of γ－PGA and biomass

2.2 氮源對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

考察了多種有機(jī)氮源和無機(jī)氮源對γ－PGA產(chǎn)量和生物量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(如表3所示)表明，無機(jī)氮源無論是對于菌體的生長還是γ－PGA產(chǎn)量效果都比較差。有機(jī)氮源效果相對較好，其中以添加酵母膏的培養(yǎng)物中γ－PGA產(chǎn)量最大，因此選擇酵母膏為氮源。

表3 不同氮源對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響Table 3 Effects of various nitrogen sources on yield of γ－PGA and biomass

2.3 谷氨酸鈉濃度對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

L－谷氨酸對微生物合成γ－PGA的影響較復(fù)雜，因菌種不同而異。根據(jù)細(xì)胞生長的營養(yǎng)要求是否需要L－谷氨酸，可以把γ－PGA產(chǎn)生菌分為兩大類:一類是培養(yǎng)時需要L－谷氨酸才能積累γ－PGA，稱之為谷氨酸依賴型菌種;另一類是培養(yǎng)時不需要L－谷氨酸也能積累γ－PGA，稱之為非谷氨酸依賴型菌種［1］。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看(如圖1所示)，當(dāng)培養(yǎng)基中未添加谷氨酸鈉時，只有微量的γ－PG產(chǎn)生，說明本研究選用的B.subtilis natto為谷氨酸依賴型γ－PGA產(chǎn)生菌，谷氨酸作為γ－PGA合成的前體物質(zhì)對γ－PGA的產(chǎn)量有很大影響。在谷氨酸鈉濃度為20～30g/L時，γ－PGA的產(chǎn)量較高。

2.4 裝液量對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

在250mL 錐形瓶內(nèi)分別裝入 30、40、50、60、70、80mL培養(yǎng)基，在搖床轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下發(fā)酵，以考察裝液量對γ－PGA合成的影響，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速一定時，裝液量與溶解氧高低呈反相關(guān)。適度的溶解氧有利于菌體的生長與γ－PGA的合成。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，取裝液量為50～70mL/250mL錐形瓶比較適宜。

2.5 起始pH對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

圖1 谷氨酸鈉濃度對γ－PGA合成及生物量的影響Fig.1 Effect of sodium glutamate concentration on yield of γ－PGA and biomass

圖2 裝液量對γ－PGA合成及生物量的影響Fig.2 Effect of loading amount on yield of γ－PGA and biomass

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滅菌前起始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，以考察起始 pH 對發(fā)酵的影響。如圖3所示，不同的pH對菌體生長和γ－PGA產(chǎn)量都有一定影響。當(dāng)起始pH小于6.0時，菌體生長和γ－PGA合成均受到較明顯地抑制;在pH6.0～7.0時，菌體生長很好，γ－PGA產(chǎn)量也高，其中以起始pH在6.5時，γ－PGA產(chǎn)量最高。以下實(shí)驗(yàn)中均采用培養(yǎng)基起始pH6.5。γ－PGA產(chǎn)量影響很大。隨著前培養(yǎng)時間的延長，生物量和 γ－PGA產(chǎn)量不斷增大，在24h達(dá)到峰值，γ－PGA產(chǎn)量為15.01g/L，與未添加NaCl的情況相比產(chǎn)量約提高30%。γ－PGA作為某些芽孢桿菌的莢膜或黏液層的主要有機(jī)成分，其產(chǎn)量與菌種的遺傳屬性、生物量以及所處環(huán)境條件密切相關(guān)。根據(jù)B.subtilis natto CICC 20643的生長曲線，菌種大致在培養(yǎng)18～24h后進(jìn)入穩(wěn)定期(數(shù)據(jù)未列出)，因此將菌種在不受抑制的狀態(tài)下培養(yǎng)，待其進(jìn)入生長穩(wěn)定期后加入NaCl再繼續(xù)培養(yǎng)，則既保證了足夠的生物量，又形成了合成 γ－PGA的有利環(huán)境(較高滲透壓)，使γ－PGA產(chǎn)量提高。因此以下實(shí)驗(yàn)均采用將菌種前培養(yǎng)24h后添加5%NaCl再繼續(xù)培養(yǎng)24h的發(fā)酵工藝。

圖4 不同前培養(yǎng)時間下添加NaCl對γ－PGA合成及生物量的影響Fig.4 Effect of added NaCl in different pre－cultivation time on yield of γ－PGA and biomass

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal experiments

圖3 起始pH對γ－PGA合成及生物量的影響Fig.3 Effect of initial pH on yield of γ－PGA and biomass

2.6 發(fā)酵過程中添加NaCl對γ－PGA產(chǎn)量及生物量的影響

有文獻(xiàn)［6］報(bào)道在配制培養(yǎng)基時添加NaCl培養(yǎng)枯草芽孢桿菌能提高γ－PGA的產(chǎn)量，并認(rèn)為這是菌種對滲透壓提高的一種適應(yīng)機(jī)制。但我們的研究發(fā)現(xiàn)這種添加NaCl的方式使B.subtilis natto CICC 20643的生物量和γ－PGA產(chǎn)量都很低，究其原因是配制培養(yǎng)基時添加大量NaCl會形成較高的滲透壓，這對菌體的生長會造成很大程度的抑制。于是改變NaCl的添加方式，考察在發(fā)酵過程中(即將菌種前培養(yǎng)一定時間后)添加5%NaCl對發(fā)酵結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，添加 NaCl的時機(jī)對生物量和

2.7 正交實(shí)驗(yàn)對培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以上單因素實(shí)驗(yàn)確定了碳源、氮源種類以及谷氨酸鈉用量和裝液量的大致范圍。利用發(fā)酵培養(yǎng)基中主要組分進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)是培養(yǎng)條件優(yōu)化的常用辦法，因此以蔗糖、酵母膏、谷氨酸鈉和裝液量作為考察對象，進(jìn)行了4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化培養(yǎng)條件，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4所示。

通過極差分析結(jié)果可以看出，對γ－PGA合成的影響因子排序是谷氨酸鈉＞蔗糖＞裝液量＞酵母膏。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到優(yōu)化的培養(yǎng)條件為:蔗糖25g/L，酵母膏 5g/L，谷氨酸鈉 40g/L，裝液量70mL/250mL錐形瓶。在上述優(yōu)化條件下驗(yàn)證培養(yǎng)，γ－PGA平均產(chǎn)量為18.04g/L，達(dá)到了文獻(xiàn)報(bào)道的較高水平［1］，且優(yōu)于正交表中γ－PGA最高產(chǎn)量的7號方案，因此確定該方案為最終優(yōu)化方案。

3 結(jié)論

液態(tài)發(fā)酵過程中添加NaCl的工藝能明顯提高B.subtilis natto CICC 20643合成γ－PGA的產(chǎn)量。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:蔗糖25g/L，酵母膏5g/L，谷氨 酸 鈉 40g/L，Na2HPO41g/L，NaH2PO41g/L，MgSO40.5g/L，裝液量70mL/250mL錐形瓶，初始pH為6.5，菌種在37℃、120r/min培養(yǎng)24h后添加5%NaCl，再繼續(xù)培養(yǎng) 24h，γ－PGA的產(chǎn)量可達(dá)到18.04g/L。

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Production of poly－γ－glutamic acid by submerged fermentation with Bacillus subtilis natto

ZHU Dan1，ZOU Shui－yang1，*，KANG Jian－xiong2
(1.School of Chemistry and Environmental Engineering，Dongguan University of Technology，Dongguan 523808，China;2.School of Environmental Science and Engineering，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)

Production of poly－γ－glutamic acid(γ－PGA)by cultivation of Bacillus subtilis natto CICC 20643 in submerged state had been studied.The optimum cultivation conditions through single factor and orthogonal experiments were set as follows:sucrose 25g/L，yeast extract 5g/L，glutamic acid 40g/L，initial pH at 6.5，culture volume 70mL in 250mL conical flask.Under the optimum cultivation conditions，B.subtilis natto was shaking cultivated at 37℃，120r/min for 24h，then 5%NaCl was added，and subsequently cultivated for another 24h.As a result，the yield of γ－PGA was got at 18.04g/L.The experimental result showed that B.subtilis natto CICC 20643 was a strain of high－yield γ－PGA and addition of NaCl in the course of cultivation could increase the yield of γ－PGA.

Bacillus subtilis natto;γ－PGA;submerged fermentation;NaCl;glutamic acid

TS201.3

A

1002－0306(2012)17－0151－04

2012－02－01 *通訊聯(lián)系人

朱丹(1980－)，女，碩士，講師，主要從事微生物發(fā)酵的研究。

東莞市高等院校科研機(jī)構(gòu)科技計(jì)劃項(xiàng)目(200910814046)。