重組海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵條件的研究

陳 穎，楊麗維，齊 欣，陳曉云，李明春，唐 柳，張 峻，*

(1.天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300112;2.南開大學(xué)微生物學(xué)系，天津 300071)

重組海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵條件的研究

陳 穎1，楊麗維1，齊 欣1，陳曉云1，李明春2，唐 柳1，張 峻1，*

(1.天津市林業(yè)果樹研究所，天津 300112;2.南開大學(xué)微生物學(xué)系，天津 300071)

目的:通過對前期構(gòu)建的海藻糖合酶基因工程菌進行高密度發(fā)酵的研究，獲得了其高密度工藝條件。方法:采用搖瓶發(fā)酵和10L自控罐高密度發(fā)酵研究了培養(yǎng)基、pH、發(fā)酵方式對工程菌生長及目的蛋白表達的影響，并考察了工程菌中重組質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果:海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的培養(yǎng)基為2YT+0.2%葡萄糖，最適pH為7.0，發(fā)酵方式為分批補料，通過10L自控罐高密度發(fā)酵最終得到的工程菌細胞密度達到了50.78g/L，酶活達到了3.197U/mL。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒在宿主中得到了穩(wěn)定遺傳。結(jié)論:優(yōu)化了海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的條件，為海藻糖規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

海藻糖合酶，基因工程菌，高密度發(fā)酵

海藻糖合酶單酶法生產(chǎn)海藻糖，由于具有嚴格的底物專一性，原料易得，產(chǎn)物組成簡單等特點成為近幾年酶法生產(chǎn)海藻糖的研究熱點［1］。海藻糖合酶由日本株式會社林原生物化學(xué)研究所首先發(fā)現(xiàn)［2］，隨后，Tsusaki等人利用放射性探針篩選基因組DNA文庫的方法，分別從Pimelobacter sp.R48和水生棲熱菌(Thermus aquaticus ATCC33923)中克隆得到了海藻糖合酶的基因［3－4］，這是最早的對海藻糖合酶基因的報道。隨后不久，De Smet等人克隆了結(jié)核分枝桿菌的海藻糖合酶，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了異源表達［5］。目前，來源于多種菌株的海藻糖合酶基因均已在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達。然而產(chǎn)海藻糖合酶基因工程菌普遍存在的產(chǎn)酶水平較低、酶制備成本較高等不利因素，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。基因工程菌(細胞)的高密度發(fā)酵是外源基因?qū)崿F(xiàn)高水平表達，獲得大量外源基因產(chǎn)物的重要工藝技術(shù)。高密度發(fā)酵技術(shù)不僅可減少培養(yǎng)體積，強化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，極大地提高其在市場上的競爭力［6］。但外源蛋白的表達水平受宿主細胞、重組體的穩(wěn)定性、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)過程中抑制性代謝產(chǎn)物的積累等多種因素的影響，能否實現(xiàn)高密度培養(yǎng)及高目標產(chǎn)物濃度，是工程菌能否以較低成本實現(xiàn)規(guī)模生產(chǎn)的決定性因素。蒙健宗、黃日波等人利用pH－stat法對重組海藻糖合酶工程菌進行40L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵，最終獲得的細胞密度為51.5g/L，是分批培養(yǎng)的7.5倍。誘導(dǎo)后重組海藻糖合成酶表達率為15.2%，單位體積內(nèi)的表達量是分批培養(yǎng)的4.5倍［7］。本項目組從一株紅色亞棲熱菌中克隆得到了海藻糖合酶基因［8］，并利用混合質(zhì)粒PCR篩選的方法獲得了其全長基因，構(gòu)建了含有海藻糖合酶基因的大腸桿菌質(zhì)粒(PET21TreS)，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21a中，得到了重組海藻糖合酶的基因工程菌［9］。本文以該工程菌為生產(chǎn)菌株，對其進行高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化和研究。

表1 7種不同培養(yǎng)基組成成分Table 1 Different components of seven culture mediums

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

海藻糖合酶基因工程菌(PET21TreS/BL21(DE3)) 南開大學(xué)生命科學(xué)院構(gòu)建，－20℃甘油凍干保存;平板培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基加終濃度100μg/mL的氨芐青霉素;種子培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基加終濃度100μg/mL的氨芐青霉素;高密度發(fā)酵培養(yǎng)基 選取大腸桿菌發(fā)酵常用培養(yǎng)基，并通過改良，比較了7種不同組分的培養(yǎng)基(見表1)對海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的細胞密度與酶活的影響;補料培養(yǎng)基 胰蛋白胨 128g/L，酵母粉 80g/L，硫酸鎂10g/L，葡萄糖448g/L;胰蛋白胨、酵母粉、氨芐青霉素、IPTG、咪唑 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司;葡萄糖 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純;泡敵 天津開發(fā)區(qū)樂泰化工有限公司，分析純。

10－100L自控發(fā)酵罐 鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司;智能型超聲波細胞粉碎機 上海之信儀器有限公司;恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠;電子顯微鏡 日本HITACHI公司;超凈工作臺 天津醫(yī)療凈化設(shè)備廠;高速冷凍離心機 湘儀離心機公司;雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻糖合酶基因工程菌搖瓶發(fā)酵條件的確定

1.2.1.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選 種子液制備:挑取一陽性轉(zhuǎn)化菌落接種于5mL含100μg/mL氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，37℃，過夜培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng):按1%接種量將種子液分別接種至7種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶裝液 100mL)，37℃，pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)。按照 pH－stat法，定時補料2mL。發(fā)酵20h后，加入終濃度1.0mmol/L的IPTG溶液，37℃，pH7.0條件下誘導(dǎo)4h。定時取樣測葡萄糖濃度、細胞密度及酶活。

1.2.1.2 發(fā)酵方式對細胞密度及酶活的影響 分批發(fā)酵:按1%接種量將種子液接種至100mL 2YT培養(yǎng)基中(裝于500mL三角瓶中)，發(fā)酵50h，定時取樣測細胞密度。分批補料發(fā)酵:按1%接種量將種子液接種至100mL 2YT培養(yǎng)基中(含0.2%葡萄糖)，定時取樣測葡萄糖濃度，當初始葡萄糖耗盡后開始補料。按pH－stat法補料，定時取樣測細胞密度，并通過光學(xué)顯微鏡觀察菌體生長狀況。

1.2.1.3 高密度發(fā)酵最適pH 按1%接種量將種子液分別接種至 pH 為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0不同條件下的2YT+葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中(500mL三角瓶裝液100mL)，37℃發(fā)酵培養(yǎng)。按照pH－stat法，定時添加補料液。定時取樣測細胞密度和酶活。

1.2.2 10L自控發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

1.2.2.1 種子液的制備 一級種子液:取平板上陽性轉(zhuǎn)化的單個菌落接于5mL含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。二級種子液:將上述一級種子液離心清洗后以1%的接種量接于100mL含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8，備用。

1.2.2.2 10L自控式發(fā)酵罐培養(yǎng)條件 10L發(fā)酵罐裝發(fā)酵培養(yǎng)基4L，將種子液按2.5%接種量接入，保持罐溫 37℃、pH7.0、罐壓 0.05MPa、攪拌速率 500～600r/min、通氣量 6～7L/min，通過 pH－stat法控制補料，定時取料檢測。

1.2.2.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性研究［10］分別于 3、12、20、26h取樣，考察不同時間不同條件下質(zhì)粒的缺失率，來判定質(zhì)粒的穩(wěn)定性。取一接種環(huán)發(fā)酵液溶于3mL的LB液體培養(yǎng)基中，適當稀釋后取40μL涂LB平板，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取100個單菌落于含終濃度100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)16h后，計算菌落個數(shù)。

質(zhì)粒穩(wěn)定性(%)=添加Amp平板上的菌落數(shù)/不添加Amp平板上的菌落數(shù)×100

1.3 分析方法

1.3.1 生物量分析(OD600) 取0.5mL發(fā)酵液定量稀釋后于600nm處測吸光度。

1.3.2 葡萄糖含量測定 葡萄糖標準曲線法。

1.3.3 酶活測定 將發(fā)酵后的粗酶液超聲破碎后，將1mL粗酶液加入到1mL以pH7.0、10mmol/L的磷酸緩沖液配制的2%(w/v)的海藻糖溶液中，50℃反應(yīng)60min，然后于100℃加熱10min中止酶反應(yīng)。反應(yīng)混合物冷卻后12000r/min離心10min，取上清液用0.22μm的濾膜過濾，用高效液相色譜法測定生成的海藻糖含量。

酶活力單位定義為:在上述反應(yīng)條件下，每分鐘形成1μmol海藻糖所需的酶量定義為1U。

2 結(jié)果與討論

2.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基

實驗通過搖瓶發(fā)酵對7種大腸桿菌常用培養(yǎng)基(見表1)進行了實驗比較，發(fā)現(xiàn)以2YT加0.2%葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基時，工程菌的細胞密度和酶活均高于其它7種培養(yǎng)基(圖1～圖2)。實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)基中加入一定濃度的葡萄糖有助于菌體的生長，尤其在菌體生長的中后期，細胞密度較未加葡萄糖的提高35%，這說明海藻糖合酶基因工程菌在生長階段，尤其是對數(shù)生長期對碳源和氮源的需求量比較大，而2YT培養(yǎng)基富含豐富的氮源，再加入一定量的葡萄糖，能滿足菌體快速生長的需要。

圖1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的細胞密度Fig.1 The cell density after different culture medium fermentation

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后的酶活Fig.2 The enzyme activity after fermentation in different medium

2.2 發(fā)酵方式的比較

實驗對分批發(fā)酵與分批補料發(fā)酵進行了比較(圖3)，分批補料培養(yǎng)過程中，實驗采用了pH－stat法通過對發(fā)酵液進行定時補料和加堿，始終控制發(fā)酵液pH維持在7.0左右。取樣檢測結(jié)果顯示，分批發(fā)酵的細胞密度生長速度很快，但20h后呈現(xiàn)出下降趨勢，而分批補料發(fā)酵前期緩慢生長，但最高細胞濃度明顯大于分批發(fā)酵。經(jīng)進一步鏡檢發(fā)現(xiàn)，24h后分批發(fā)酵菌體有自溶現(xiàn)象(圖4)，而分批補料由于連續(xù)不斷地為菌體生長提供了豐富的碳源和氮源，24h后菌體仍保持正常分裂(圖5)。

圖3 不同發(fā)酵方式下菌體的生長情況Fig.3 Cell growth after different fermentation mode culture

圖4 分批發(fā)酵24h后菌體生長情況Fig.4 The bacterial growth after batch fermentation 24h

圖5 分批補料發(fā)酵24h后菌體生長情況Fig.5 The bacterial growth after fed－batch fermentation 24h

2.3 最適pH

實驗分別于發(fā)酵5、24、31、48h取樣比較不同pH下(pH 分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)菌體生長情況及酶活大小(見圖6～圖7)，發(fā)現(xiàn)pH7.0時細胞密度及酶活均優(yōu)于其他pH條件，因此后面的實驗均采用7.0作為發(fā)酵pH。

圖6 不同時間不同pH培養(yǎng)的細胞密度(OD600)Fig.6 The cell density after different time and different pH fermentation

2.4 10L自控罐分批補料發(fā)酵條件

圖7 不同pH發(fā)酵培養(yǎng)48h后的酶活Fig.7 The enzyme activity after different pH fermentation 48h

實驗采用10L自控式發(fā)酵罐，裝料量為4L，通氣量為7L/min，pH7.0，保持罐溫 37℃，罐壓 0.05MPa，攪拌速率500～600r/min，消泡以泡敵手動消泡，其余條件均為自動控制。按照發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH變化設(shè)定補料時間，補料采用連續(xù)流加的方式，培養(yǎng)24h后收集發(fā)酵液備用。

2.4.1 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵過程中pH及溶解氧的變化 發(fā)酵過程中采用pH－stat法，設(shè)定初始pH為7.0，發(fā)酵罐裝液量為4L，通氣量為6L/min，罐溫始終保持在37℃，罐壓始終保持在0.05MPa。發(fā)酵初始，發(fā)酵液pH始終呈下降趨勢，表明菌體充分利用了發(fā)酵液中的初始葡萄糖，并產(chǎn)生了發(fā)酵副產(chǎn)物乙酸使得發(fā)酵液pH下降，實驗通過自動添加15%氨水調(diào)整pH為7.0。發(fā)酵至240min左右，發(fā)酵液pH持續(xù)上升(每分鐘上升0.01)。取樣測葡萄糖濃度后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中的初始葡萄糖已基本耗盡。而此時菌體生長代謝產(chǎn)生的銨離子使發(fā)酵液的pH持續(xù)升高。此時通過連續(xù)流加補充葡萄糖和氮源，使得菌體重新利用葡萄糖并產(chǎn)生乙酸使發(fā)酵液pH回落至7.0。補料20h后停止補料，以致發(fā)酵后期pH持續(xù)上升(見圖8)。

圖8 重組海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵走勢圖Fig.8 High density fermentation chart of recombinant trehalose synthase engineering

隨著發(fā)酵時間的延長溶解氧迅速下降。發(fā)酵3h左右，溶解氧降至5%左右，此時調(diào)整轉(zhuǎn)速，將轉(zhuǎn)速由500r/min提高至600r/min后，溶解氧上升至25%左右，隨后很快又下降，直至發(fā)酵4h后降至10%。由于實驗條件有限無法通入純氧來維持菌體生長的需要，因此在一定程度上影響了菌體的比生長率。

2.4.2 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵過程中細胞濃度與葡萄糖濃度的變化 如圖9所示，細胞密度快速上升的同時發(fā)酵液中的葡萄糖濃度迅速下降，說明菌體生長過程對葡萄糖的利用很快。初始葡萄糖的添加濃度為2g/L，縮短了前期初始葡萄糖的耗盡時間，延長了補料時間，從而使得發(fā)酵液中的葡萄糖濃度始終處于一個較低水平(＜1g/L)，有效控制了乙酸的生成，延長了菌體對數(shù)生長期的時間。實驗于發(fā)酵中后期(20h)加入1.0mmol/L的誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為37℃，時間為4h。

圖9 10L高密度發(fā)酵過程中細胞密度與葡萄糖濃度的變化Fig.9 The cell density and glucose concentration changes of 10L high－density fermentation process

2.5 10L自控罐高密度發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵的比較

通過pH－stat法進行重組海藻糖合酶10L自控罐高密度發(fā)酵，并改進了發(fā)酵培養(yǎng)基和補料策略，最終獲得的細胞密度達到LB搖瓶發(fā)酵的21倍，酶活為LB培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵的5.5倍。

表2 10L自控罐高密度發(fā)酵與常規(guī)發(fā)酵的細胞密度及酶活比較Table 2 The cell density and activity of 10L high cell density and conventional fermentation

2.6 質(zhì)粒穩(wěn)定性研究

通過考察不同時間段溫度、pH、溶解氧及補料條件等因素對質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響(見表3)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前期在溫度、pH、壓力恒定的條件下，溶解氧 ＞40%時，質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳達能到100%。發(fā)酵12h時，溫度、pH、壓力恒定的條件下，溶解氧降到10%左右，而通過補料，質(zhì)粒穩(wěn)定性仍能達到100%，發(fā)酵至24h后其他條件不變，而溶解氧＜10%(已經(jīng)持續(xù)10h)，質(zhì)粒穩(wěn)定性能達到95%，證明重組海藻糖合酶菌株在高密度發(fā)酵過程中能正常遺傳。

表3 重組海藻糖合酶工程菌質(zhì)粒穩(wěn)定性Table 3 Plasmid stability of recombinant trehalose synthase engineering

3 結(jié)論

3.1 海藻糖合酶工程菌高密度發(fā)酵條件的優(yōu)化

本實驗通過對已構(gòu)建的海藻糖合酶基因工程菌進行搖瓶發(fā)酵條件的研究，確定了海藻糖合酶基因工程菌高密度發(fā)酵的最適培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基，發(fā)酵初始葡萄糖濃度為0.2%，菌體生長最適pH為7.0，最佳發(fā)酵方式為分批補料法。

3.2 10L自控式發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的研究

實驗采用10L自控式發(fā)酵罐，裝液量為4L，發(fā)酵溫度為37℃，pH為7.0，通氣量為7L/min，罐壓為0.05MPa。通過pH－stat法控制加堿和定時補料，發(fā)酵過程中以15%氨水控制加堿，在初始葡萄糖耗盡后(發(fā)酵4h)定時補料，將發(fā)酵液pH維持在7.0左右，補料方式為連續(xù)流加，補料液的體積為總發(fā)酵液的20%，流速為 0.7mL/min，葡萄糖濃度維持在＜1g/L，以減少副產(chǎn)物乙酸的生成，延長了工程菌對數(shù)期的生長時間，大大提高了菌體的發(fā)酵密度，最終得到的海藻糖合酶基因工程菌的細胞密度達到了50.78g/L。在發(fā)酵20h后加入濃度為1.0mmol/L的IPTG誘導(dǎo)、誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時間為4h，得到的重組海藻糖合酶的酶活達到了3197U/L，為LB搖瓶發(fā)酵的5.5倍。

3.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性

10L自控罐發(fā)酵過程中基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性達到了95%以上，說明重組海藻糖合酶工程菌的質(zhì)粒比較穩(wěn)定，在高密度過程中可正常遺傳。

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High cell density fermentation condition of trehalose synthase genetic engineering bacteria

CHEN Ying1，YANG Li－wei1，QI Xin1，CHEN Xiao－yun1，LI Ming－chun2，TANG Liu1，ZHANG Jun1，*
(1.Tianjin Institute of Forest and Pomology，Tianjin 300112，China;2.Department of Microbiology，Nankai University，Tianjin 300071，China)

Object:To obtain the high dense fermentation procedure of trehalose synthase(Tres)genetic engineering bacteria previously construct.Methods:Studied the influence of medium，pH，ferment mode for incubation and induction on the growth of recombinant genetic engineering bacterial and expression of target protein in a 10L auto control biostat fermentator，and explored the genetic stability of recombinant plasmid.Result:The high－density culture medium of trehalose synthase genetic engineering bacteria was 2YT+0.2%glucose，the optimum pH was 7.0，the ferment mode was fed－batch.After the recombinant genetic engineering bacterial strain cultured in 10L high－density fermentation，the density of bacteria reached 50.78g/L，the enzyme activity reached 3.197U/mL.The constructed recombinant plasmid was inherited steadily in host bacteria.Conclusion:The high－density fermentation condition of trehalose synthase genetic engineering bacteria was optimized.It laid a foundation of large－scale production of trehalose.

trehalose synthase(Tres);genetic engineering bacteria;high－density fermentation

TS201.2

A

1002－0306(2012)17－0154－05

2012－02－22 *通訊聯(lián)系人

陳穎(1977－)，女，碩士，助理研究員，主要從事食品微生物和食品加工方面的研究。

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃(10JCYBJC09600，10JCYBJC05000);國家自然科學(xué)基金(21076162)。