新疆酸馬奶中抗氧化益生乳酸菌的篩選

車 馳，李海英，姚新奎，唐血梅，董 婷，孟 軍，祝春梅，曾亞琦，劉婷婷，韓煜茹

(新疆農業大學，新疆烏魯木齊 830052)

新疆酸馬奶中抗氧化益生乳酸菌的篩選

車 馳，李海英，姚新奎*，唐血梅，董 婷，孟 軍，祝春梅，曾亞琦，劉婷婷，韓煜茹

(新疆農業大學，新疆烏魯木齊 830052)

目的:篩選出性狀優良、具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，為開發具有抗氧化活性的功能性食品提供理論依據。方法:通過菌株對H2O2的耐受能力實驗、羥自由基清除實驗、還原活性測定實驗以及亞鐵離子螯合能力測定實驗，對28株乳酸菌活細胞體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行測定。結果:兩株益生乳酸菌S3、Y11具有較高的抗氧化能力，對實驗所用的不同濃度過氧化氫具有一定的耐受能力;當添加樣品量為1.5mL時，兩株菌的活細胞體和無細胞提取物對羥自由基的清除率分別為38.1%和25.2%，52.3%和29.7%;兩株菌均具有還原活性，A700nm值分別為2.272和3.083;兩株菌對亞鐵離子(Fe2+)的螯合率分別為36.62%和43.16%。結論:28株乳酸菌菌株的抗氧化能力存在差異，乳酸菌菌體內可能含有較多的起抗氧化作用的活性物質，并篩選出2株具有較強抗氧化能力的乳酸菌菌株。

抗氧化，益生乳酸菌，篩選，還原能力

氧化作用是有機體的必要代謝過程，但是過度的氧化作用會造成生物大分子的損傷［1］。氧化代謝過程中不斷產生各種活性氧分子(ROS)，如羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(·)、烷氧自由基(RO·)、過氧化氫(H2O2)等，可對 DNA、脂質及蛋白質造成損傷，并引發諸如癌癥、動脈硬化、糖尿病、心血管病等多種疾病［2－4］。乳酸菌具有多種生理功能［5］，如緩解腹瀉，調節腸道菌群平衡;降低血脂膽固醇水平;調節血壓作用;提高免疫功能［6－9］等。研究表明:某些乳酸菌具有顯著的抗氧化活性，孟和畢力格等報道了酸馬奶中的嗜酸乳桿菌MG2－1菌株具有抗氧化活性［10］。在檢測乳酸菌的抗氧化活性時，目前主要測定菌株耐受H2O2的能力、清除超氧陰離子自由基(·)的能力、清除羥自由基(·OH)的能力、螯合Fe2+的能力、抗脂質過氧化能力、清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)的能力及還原活性。本研究通過菌株對H2O2的耐受能力實驗、羥自由基清除實驗、還原活性測定實驗以及亞鐵離子螯合能力測定實驗，對新疆少數民族地區傳統自制酸馬奶中的28株乳酸菌的活細胞體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行測定，從中篩選出具有較好抗氧化活性的益生乳酸菌。為將具有抗氧化活性的乳酸菌應用于功能性食品的開發和生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

28株乳酸菌菌株 編號S1～S14，樣品采于新疆烏魯木齊水西溝牧民家庭自制酸馬奶;Y1～Y14 樣品采于伊犁地區牧民家庭自制酸馬奶，由實驗室分離、保存;MRS培養基 蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，檸檬酸氫二氨2g，KH2PO42g，吐溫 80 1mL，MnSO4·4H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，瓊脂 15g，溴甲酚綠 0.03g，加水定容至 1000mL，pH6.2～6.4，滅菌，接入樣品前加入0.4mmol/L H2O2;PBS 緩沖液 NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·7H2O 1.14g，KH2PO40.24g，加水定容至1000mL，pH7.4;鐵氰化鉀、L﹣半胱氨酸鹽酸鹽、過氧化氫、FeSO4、鄰－菲羅啉、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸等試劑 均為國產分析純。

TGL－16M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;TU－1810紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;立式壓力蒸汽滅菌器、數顯電熱培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;超聲波細胞粉碎儀 JY96－IIN;酸度計美國梅特勒－托利多儀器有限公司;恒溫水浴振蕩器 北京桑翌實驗儀器研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的培養及菌體、胞外分泌物、無細胞提取物的制備 供試菌于MRS培養基37℃靜置培養24h后，發酵液5000r/min離心15min，收集菌體，并用雙蒸水洗滌3次，最后用雙蒸水將乳酸菌的菌數調整到1010cfu/mL，即為待測菌體(IC)。

供試菌于MRS培養基37℃靜置培養24h后，收集發酵液，用雙蒸水將乳酸菌的菌數調整到1010cfu/mL，在5000r/min轉速下離心15min，收集上清液，即為胞外分泌物。

供試菌于MRS培養基37℃靜置培養24h后，發酵液5000r/min離心15min，收集菌體，用PBS洗滌3次，重懸于PBS，調整菌數到1010cfu/mL，冰浴超聲破碎細胞，4℃ 12000×g離心30min，收集上清液，即為無細胞提取物(CFE)［11］。

1.2.2 乳酸菌在不同濃度H2O2溶液中的耐受能力測定 在100mL滅過菌的三角瓶中加入60mL MRS培養基，分別添加過氧化氫溶液，使培養基中的起始H2O2濃度分別為0.4、0.7、1.0mmol/L，并按體積分數1%的接種量接入分離所得的菌株培養液，置于37℃恒溫培養箱中培養24h，取樣測定OD600值，觀察每株菌在不同起始過氧化氫濃度下的生長趨勢，篩選具有高過氧化氫耐受性的乳酸菌［12］。

1.2.3 乳酸菌清除羥自由基(·OH)能力的測定在10mL具塞試管中依次加入5mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，5mmol/L水楊酸－乙醇溶液1mL，3mmol/L雙氧水溶液1mL，混合均勻后加入不同體積(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL)的待測液，與待測液相同體積的1mmol/L的抗壞血酸做陽性對照，用雙蒸水補齊至刻度，在(37±0.1)℃的恒溫水中反應15min后，6000r/min離心 10min，然后以雙蒸水做參比，在510nm下測定吸光度［13］。計算清除率:

其中A0為對照液的吸光度，Ax為加入待測液后的吸光度，每一吸光值平行測三次，取其平均值。

1.2.4 乳酸菌還原活性的測定 反應液中乳酸菌待測液0.5mL，1%鐵氰化鉀0.5mL，磷酸鹽緩沖液(PBS 0.2mol/L，pH6.6)0.5mL，混合后在 50℃ 水浴中反應20min，冷卻并加入10%三氯乙酸0.5mL，沉淀蛋白，離心后取1mL上清液與1mL 0.1%三氯化鐵反應，于700nm測吸光值，其中L－半胱氨酸鹽酸鹽(1%)作為標品［14］。

1.2.5 乳酸菌與亞鐵離子(Fe2+)螯合能力的測定1% 抗 壞 血 酸 0.1mL，0.4% FeSO40.1mL，NaOH(0.2mol/L)1mL的混合液加入0.5mL的乳酸菌的待測液，混合液37℃水浴20min，三氯乙酸沉淀蛋白，3000×g、4℃離心10mim，取0.2mL上清液加入2mL 0.1%鄰－菲羅啉反應10min，于510nm測吸光值，以磷酸鹽緩沖液(PBS 0.2mol/L，pH6.6)作為空白對照［15］。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌在不同濃度過氧化氫溶液中的耐受能力

過氧化氫是一種強氧化劑，可以對細胞和組織造成直接破壞，或作為羥自由基(·OH)前體間接參與氧化過程。

將乳酸菌菌株分別接種于含有不同濃度的過氧化氫培養基中，37℃培養24h，檢測其菌體濃度(OD600值表示)，結果見表1～表2。

從表1～表2可以看出，S3、Y6、Y11三株乳酸菌在過氧化氫濃度分別為0.4、0.7、1.0mmol/L的培養基中生長所測得的OD600值與空白溶液中的OD600沒有太大的變化，表明這三株乳酸菌在實驗所用的過氧化氫濃度下其生長幾乎不受影響，說明這三株乳酸菌對過氧化氫有一定的耐受能力。

2.2 乳酸菌對羥自由基(·OH)的清除能力

本實驗對S3、Y6、Y11三株菌的菌體及無細胞提取物進行了羥自由基清除能力的研究，以對羥自由基具有較強清除能力的抗壞血酸做陽性對照，結果見圖1～圖3。

圖1 乳酸菌S3菌體及無細胞提取物清除羥自由基能力Fig.1 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain S3

從圖1～圖3可以看出，三株乳酸菌S3、Y6、Y11的活細胞體及無細胞提取物均表現出一定的清除羥自由基的能力，當添加樣品量為1.5mL時，乳酸菌S3的活細胞體及無細胞提取物對羥自由基的清除率分別為38.1%和25.2%;乳酸菌Y6的活細胞體及無細胞提取物對羥自由基的清除率分別為50.3%和30.6%;乳酸菌Y11的活細胞體及無細胞提取物對羥自由基的清除率分別為52.3%和29.7%，而添加相同體積的1mmol/L的抗壞血酸，其對羥自由基的清除率為22.8%。另外，乳酸菌對羥自由基的清除能力與乳酸菌的添加量呈現正比關系。

2.3 乳酸菌的還原活性

一般情況下，樣品的還原力與抗氧化能力呈正相關，于700nm波長測定吸光度，吸光度越大，表明樣品的還原能力越強。結果見表3～表4。

從表3～表4可以看出，28株乳酸菌均表現出一定的還原能力，其中菌株 S3、S8、S11、Y5、Y6、Y10、Y11、Y12的還原能力比標品的還原能力強，其中菌株Y11的還原能力最強，A700nm為3.083;菌株S1的還原能力最弱，A700nm為0.043。實驗表明:乳酸菌具有還原能力的活性物質的含量在不同菌株間具有差異。

表1 含有不同濃度H2O2培養基中乳酸菌的菌體濃度Table 1 Density of lactobacillus in media with various H2O2concentrations

表2 含有不同濃度H2O2培養基中乳酸菌的菌體濃度Table 2 Density of lactobacillus in media with various H2O2concentrations

表3 乳酸菌菌株胞外分泌物的還原能力Table 3 Reducing activity of extracellular secretion from lactobacillus

表4 乳酸菌菌株胞外分泌物的還原能力Table 4 Reducing activity of extracellular secretion from lactobacillus

表5 乳酸菌體與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力Table 5 Ferrous ion chelating abilities of lactobacillus

表6 乳酸菌體與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力Table 6 Ferrous ion chelating abilities of lactobacillus

圖2 乳酸菌Y6菌體及無細胞提取物清除羥自由基能力Fig.2 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain Y6

2.4 乳酸菌與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力

圖3 乳酸菌Y11菌體及無細胞提取物清除羥自由基能力Fig.3 ·OH－scavenging capabilities by live cells and cell－free extracts of strain Y11

有些蛋白質常會結合亞鐵離子(Fe2+)，在特定位置上形成羥基，促進脂質過氧化反應的進行，引起生物大分子的損傷。各菌株對亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力結果見表5～表6。

從表5～表6可以看出，28株乳酸菌菌體對亞鐵離子(Fe2+)均有一定的螯合能力，其無細胞提取物對亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力較弱。乳酸菌S3、Y5、Y10、Y11對亞鐵離子(Fe2+)的螯合率分別為36.62%、38.71%、31.03%、43.16%，高于其余菌株。實驗結果表明:乳酸菌菌體組成成分中可能含有較多的螯合亞鐵離子(Fe2+)的活性物質。

3 結論

本研究以具有抗氧化活性為篩選指標，對28株乳酸菌的活細胞體、無細胞提取物以及胞外分泌物的抗氧化能力進行測定，從中篩選出兩株益生乳酸菌S3、Y11，兩株菌在過氧化氫溶液中具有較好的耐受性，具有較高的清除羥自由基的能力和螯合亞鐵離子(Fe2+)的能力，具有高效的還原活性。實驗結果表明:乳酸菌菌體內可能含有較多的起抗氧化作用的活性物質，下一步應分離出這種起抗氧化作用的活性物質，并對其進行深入研究，為將具有抗氧化活性乳酸菌應用于功能性食品的開發和生產提供充分的理論依據。

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Screening of antioxidative lactobacillus from Koumiss in Xinjiang

CHE Chi，LI Hai－ying，YAO Xin－kui*，TANG Xue－mei，DONG Ting，MENG Jun，ZHU Chun－mei，ZENG Ya－qi，LIU Ting－ting，HAN Yu－ru
(Xinjiang Agricultural University，Urmuqi 830052，China)

Objective:In order to provide theoretical evidences for developing functional food with antioxidative activity，lactobacillus strains with antioxidative activity were selected.Methods:The antioxidant capabilities of 28 lactobacillus strains of live cells，cell－ free extracts and extracellular secretions were determined through H2O2tolerance capability，scavenging capabilities of hydroxyl free radical，reducing activities and chelation abilities of ferrous ion.Results:S3 and Y11 displayed the excellent antioxidant capabilities among 28 lactobacillus strains.The two desired strains showed excellent tolerance in different concentration of H2O2in culture media;Scavenging efficiencies of S3 and Y11 cell suspension and cell－free extracts were 38.1%，25.2%and 52.3%，29.7%for hydroxyl free radicals when addition level was 1.5mL;The two lactobacillus strains showed good reducing activities，the values of A700nmwere 2.272 and 3.083;The percentage of chelating ferrous ion(Fe2+)capacity were 36.62%and 43.16%，respectively.Conclusion:28 lactobacillus strains had different antioxidant capabilities.Antioxidative active substances might exist in lactobacillus live cells，and 2 lactobacillus strains with antioxidative activity were selected.

antioxidative activity;lactobacillus;screening;reducing activity

TS252.1

A

1002－0306(2012)17－0176－04

2011－10－24 *通訊聯系人

車馳(1985－)，女，在讀碩士研究生，研究方向:乳及乳制品質量安全控制技術。

國家農業部公益性行業專項(201003075);新疆維吾爾自治區科技重大專項(201130101)。