高效液相測定血中谷氨酰胺的研究

查登峰

·實驗研究·

高效液相測定血中谷氨酰胺的研究

查登峰

目的 探討高效液相色譜法測定血中谷氨酰胺的含量。方法 固定相反相C18(規格:0.46 mm×250 mm)，流動相為50 mmmol/L醋酸緩沖液(pH為6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速1.0 ml/min，柱溫46℃，檢測波長為254 nm，進樣量取10 μl。結果 谷氨酰胺在濃度范圍(0.05～2.60)μg/ml之間有良好的線性關系，r=0.9989，批間、批內變異系數分別為2.87%、2.58%，兩種高低濃度的回收率分別為102.9%、97.0%。結論 本研究方法專屬性強、重復性好、結果準確，為血中谷氨酰胺的含量測定提供了科學、專屬的方法。

高效液相色譜法;血清;谷氨酰胺

目前有很多研究顯示，谷氨酰胺(GLN)為人體中大多器官與組織所需的特殊營養物質，故亦稱“基本營養素”，系腸外營養的重要成分［1］。但GLN不溶于水，遇熱不穩定等，因此只能經雙肽鍵以丙氨酸與其結合，合成穩定丙氨酰-谷氨酰胺的雙肽分子，此雙肽分子進入機體后可很快分解成單體的谷氨酰胺與丙氨酸，因此雙肽鍵在人體中打開率對丙氨酰-谷氨酰胺注射液在臨床上應用的藥效評價是十分重要。本文筆者通過測定血中GLN濃度及血清GLN健康者的參考值，分別對丙氨酰谷氨酰胺注射液(商品名:多蒙特，四川科倫藥業股份有限公司，國藥準字:H20043702)和另外丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內某制藥有限公司)，探索我院行腹部大手術患者采用經谷氨酰胺強化安全腸外營養后血清中的GLN濃度情況。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀(美國，490型紫外檢測器，510型輸液泵，U6K進樣器，PICO-TAG色譜柱，810色譜工作站)，微孔濾膜(美國，Millipore公司)。

乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純;谷氨酰胺標準品(美國Sigma公司);異硫氰酸苯酯(美國Pierce公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(四川科倫藥業股份有限公司);丙氨酰谷胺酰胺注射液(國內某制藥有限公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為固定相反相C18(規格:0.46 mm×250 mm)，流動相為50 mmmol/L醋酸緩沖液(pH為6.5):乙腈(97.7∶2.3)，流速每分鐘 1.0 ml，柱溫 46℃，檢測波長為254 nm，進樣量取 10 μL。

2.2 標準溶液的制備 準確稱取18.45 mg GLN標準品，以50 ml超純水溶解混勻，即得2.5 mmmol/L GLN標準溶液，于4℃可保存。準確量取20 μLGLN標準溶液加至100 μL患者的血清中，充分混勻，即為標準血清。另外加入超純水20 μL于100 μL血清中，充分混勻，即為標準空白血清。標準血清與標準空白血清同時超濾，取濾液，分別為標準液與標準空白液。

2.3 待測血清樣本液的制備 抽取100 μL患者血清進行超濾，得無蛋白超濾液，即為待測的血清樣本液。

2.4 衍生反應 分別量取加入超純水20 μl、20 μl三乙胺及140 μl無水乙醇加入異硫氰酸苯酯中，充分混勻，即得衍生試劑，需現配現用。準確稱取355 mg磷酸氫二鈉，加入450 ml超純水進行溶解，以10%磷酸-乙腈(95∶5)混合溶液調PH為7.4，加水定容至500 ml，充分混勻，即得樣品稀釋液，于4℃冰箱保存。分別量取20 μl處理過的血清，在真空條件下抽干，加入20 μl衍生試劑，在室溫下進行反應20 min，然后再真空抽干，加入 1000 μl的樣品稀釋液，混勻，量取 10 μl進樣。

2.5 線性關系考察 量取2.5 mmol/L GLN標準溶液，以超純水對倍進行稀釋，分別獲得7個濃度:2.500、1.250、0.625、0.312、0.156、0.078 與 0.039 mmol/L，各取 20 μl，衍生和測定。橫坐標為GLN濃度(C)，縱坐標為峰面積(A)，進行線性回歸。結果顯示GLN標準溶液在濃度范圍(0.05～2.60)mmol/L之間有良好的線性關系，r=0.9989。

2.6 重復性試驗 精密量取12份1.25 mmol/L GLN標準溶液，在上述色譜條件下進樣，測得批間變異系數為2.87%，批內變異系數為2.58%。

2.7 干擾試驗 取混合氨基酸標樣(不含GLN)，分為兩份，其中一份加至350 μmol/L的GLN中，兩份均按照上述方法處理并進樣。結果顯示GLN峰保留時間為11.09 min，其鄰近2個峰分別為β-丙氨酸(保留時間12.33 min)、甘氨酸(保留時間10.02 min)，GLN峰位置沒有受到任何氨基酸及其他雜峰干擾。

2.8 穩定性試驗 分別在衍生0、2、4、6 h精密吸取同一血清標本10 μl，進樣測定，結果顯示RSD=0.020%，說明血清標本在室溫6 h內的穩定性佳。

2.9 回收試驗 分別取2份健康人群的血清，均按照找上述方法測定GLN濃度，分別獲得結果為597、608 mmol/L，再分別加入1.25、0.156 mmol/L兩種高低濃度GLN標準溶液，各10 μl，混勻，依法測定GLN的濃度，計算回收率。結果顯示兩種高低濃度的回收率分別為102.9%、97.0%。

3 討論

2001年國外已有研究采用高效液相色譜法測定GLN，其在GLN衍生后以磷酸緩沖液-甲醇行單泵恒定溶劑的等梯度洗脫［2］。近年來國內學者認為采用單泵恒溶劑洗脫，GLN與雜峰不能徹底地分離，故以雙泵雙流動相行梯度洗脫［3］。但是梯度洗脫需配置2個梯度混合器與輸液泵。而事實上采用高效液相色譜法分離單一組分，其能否與雜峰徹底分開很大程度取決于能否獲得流動相中水相(緩沖液)和有機相(乙腈、甲醇)的最佳比例。本研究結果顯示，GLN在乙腈濃度為2.3%時分離效果最好，采用單泵恒溶劑洗脫即與其他雜峰完全分離，分析時間僅需15 min，同時峰形佳。

本研究在處理樣品時運用離心超濾法除去血中蛋白質。有文獻指出取血漿0.4 ml超濾，得20 μl超濾液即可行衍生與色譜分析［4］。本文筆者認為外標法因受到超濾膜吸附與殘留影響，超濾血漿后體積發生變化，此時測得的GLN含量與實際濃度必然具有一定的差異。本研究為了保持實驗條件一致性，消除上述誤差，故取同一血清分為標準血清與標準空白血清2份，均與相同的條件下超濾、衍生反應及色譜分析，以標準血清與標準空白血清峰面積之差計算結果，即作為標準品實際峰面積來計算待測血中GLN含量，使結果更可靠、準確。

本研究采用PITC作為GLN的衍生劑，因其在實驗過程中不受時間的限制［5］，而衍生產物于室溫條件下保存6 h后結果也不存在顯著的差異，于檢測波長254nm處具有特征峰吸收，且無其他雜峰的干擾，獲得了滿意的結果。

近年來臨床上采用谷氨酰胺強化的完全腸外營養來對危重患者及術后患者進行治療與護理。本臨床試驗也表明，實驗組患者于手術前后連續7 d采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科倫藥業股份有限公司)的腸外營養后，血中GLN濃度明顯高于對照組采用的丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內某制藥有限公司)，兩者差異具有統計學意義(P＜0.05)。本研究方法專屬性強、重復性好、結果準確，為血中谷氨酰胺的含量測定提供了科學、專屬的方法。

［1］ Poindexter BB，Ehrenkranz RA，Stoll BJ，et al.Parenteral glutamine supplementation does not reduce the risk of mortality or lateonset sepsis in extremely low birth weight infants.Pediatrics，2004，113(5):1209-15.

［2］ Gu Y，Wu ZH，Xie JX，et al.Effects of growth hormone(rhGH)and glutamine supplemented parenteral nutrition on intestinal adaptation in short bowel rats.Clin Nutr，2001，20(2):159-66.

［3］ Hasebe M，Suzuki H，Mori E，et al.Glutamate in enteral nutrition:can glutamate replace glutamine in supplementation to enteral nutrition in burned rats?.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S78-82.

［4］ Neu J，DeMarco V，Weiss M.Glutamine supplementation in lowbirth-weight infants:mechanisms of action.JPEN J Parenter Enteral Nutr，1999，23(5 Suppl):S49-51.

［5］ Lai YN，Yeh SL，Lin MT，et al.Glutamine supplementation enhances mucosal immunity in rats with Gut-Derived sepsis.Nutrition，2004，20(3):286-91.

333000江西省景德鎮市第二人民醫院藥劑科

2.10 血清GLN的參考值測定 取30份健康人群的空腹血清標本，均按照上述方法測定GLN濃度，獲得結果(616.8±67.9)μmol/L。

2.11 臨床試驗 選取我院行腹部大手術患者共30例，隨機分為實驗組與對照組，每組各15例。其中實驗組患者于術前3天始采用用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科倫藥業股份有限公司)0.5 g/kg，連續治療6 d;而對照組患者采用丙氨酰-谷胺酰胺注射液(國內某制藥有限公司)，用法同實驗組。兩組患者分別在術前3 d及術后3、7 d測定GLN濃度(見表1)。

兩組患者用藥前后血清中谷氨酰胺濃度比較見表1。結果顯示，術后7 d實驗組患者血清中的谷氨酰胺濃度明顯高于對照組患者約10%，兩者差異具有統計學意義(P＜0.05)。

表1 兩組患者用藥前后血清中谷氨酰胺濃度比較(±s，μmmol/L)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 例數 術前3 d 術后3 d 術后7 d實驗組 15 603±70 500±43 608±59*對照組15 605±61 482±39 552±51