新疆哈薩克族傳統發酵酸馬奶中酵母菌的分離鑒定

李 靜，賈佳佳，楊 艷，田 燕，武 運*

(新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

新疆哈薩克族傳統發酵酸馬奶中酵母菌的分離鑒定

李 靜，賈佳佳，楊 艷，田 燕，武 運*

(新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052)

從新疆南山、水西溝、伊犁昭蘇采集的哈薩克族傳統發酵酸馬奶中共分離得到酵母菌34株。采用傳統形態學、生理生化特性方法對酵母菌進行鑒定，鑒定結果為Schizosaccharomyces 1株、Sehizoblastosporion 1株、Torulopsis 1株、Saccharomycodes 1株、Kloechera 9株、Kluveromyces 5株、Dekker 8株、Trichosporon 3株、Hansenula 2株、Brettanomyces 3株。利用5.8S rDNA序列同源性分析和系統發育樹對菌株12號進行分子生物學鑒定，鑒定結果為：菌株12與標準菌株HQ396523.1同源性達到96%，為Kluveromyces的Kluveromyces marxianus，與傳統鑒定結果一致，表明5.8S rDNA序列分析在酵母菌鑒定上的準確性。

酸馬奶；酵母菌；分離鑒定；分子生物學

酸馬奶(koumiss)是以新鮮馬奶為原料，加入乳酸菌和酵母菌等微生物的天然發酵劑，自然發酵形成的一種酸性低乙醇含量的乳飲品[1-3]。隨著生活水平的提高，人們對飲食結構的要求越來越嚴格[4]，不僅要考慮營養價值的全面性，而且要注意被機體實際吸收利用的多少。發酵奶的營養價值和吸收利用率均比鮮奶還高，因此酸馬奶酒更引起了人們的重視[5]。由于酸馬奶酒有著特殊的有益微生物群，將來必定成為一種很理想的微生態制劑發揮它應有的作用，而且有可能從酸馬奶酒的微生物群中篩選出對結核分枝桿菌等細菌具有高度抗菌活性的微生物來，生產新型抗生素[6-8]。酵母菌體本身也有很高的利用價值，并應用于食品工業、飼料工業及生化制藥中。本實驗通過對新疆哈薩克族傳統發酵酸馬奶中酵母菌進行分離純化鑒定，為新疆哈薩克族傳統發酵酸馬奶中酵母菌菌種資源的保藏與開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

酸馬奶采集于新疆南山哈薩克族牧民家自制酸馬奶、水西溝哈薩克族牧民家自制酸馬奶、伊犁昭蘇哈薩克族牧民家自制酸馬奶。

1.1.2 培養基

分離純化用培養基：麥芽糖培養基、麥芽汁瓊脂培養基、YPD培養基；鑒定用培養基：糖發酵基礎培養基、硝酸鹽培養基、碳源同化基礎培養基、氮源同化基礎培養基、無維生素基礎培養基、產類淀粉培養基、產酸培養基、分解尿素培養基。

1.1.3 試劑

酵母菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、ZM404 DL2000 DNA Marker、dNTP Mixture (均為 2.5mmol/L)、EB染色液(10mg/L) 北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

50×TAE電泳緩沖液貯液：Tris 242g，濃度為17.4mol/L、冰乙酸57.1mL，濃度為0.5mol/L EDTA (pH8.0)200mL，定容至1000mL。0.8%的瓊脂糖凝膠：0.8g瓊脂糖溶于100mL 0.5×TAE緩沖液中；2%的瓊脂糖凝膠：2g瓊脂糖溶于100mL 0.5×TAE緩沖液中。

1.2 儀器與設備

LD2X-30KA 立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；HR40-ⅡA2 生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱、HWS26 型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；XSP-2CA 生物顯微鏡 廈門Motic實業集團有限公司；LSM 510 SYSTEM 激光共聚焦顯微鏡 北京普瑞賽司儀器有限公司；AR2130/C型精密電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；THE-82 氣浴恒溫振蕩器 常州市國立試驗設備研究所；050-810 Tgradient 48型PCR擴增儀 德國Biometra公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；JY04S型凝膠成像儀 北京君意東方電泳設備有限公司；US-Patent Research型移液槍、MiniSpin型離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌的分離與純化

吸取1mL酸馬奶置于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使其混勻。將混合后酸馬奶進行倍比稀釋，稀釋度為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，選取10-2、10-3、10-4、10-5、10-65個稀釋度，用移液器吸取1mL樣液，采用涂布法，將樣液均勻涂布于麥芽汁瓊脂培養基上，將制備好平板置于28℃恒溫培養箱中培養24～48h，觀察并記錄菌落特征，挑取菌落較大，且呈白色或乳白色、粉色單個菌落進行簡單染色，觀察細胞形態，呈圓形或橢圓形、臘腸狀且細胞較大者，將其接種于麥芽糖瓊脂培養基，于28℃恒溫培養箱中培養24～48h，重復幾次純化酵母菌，直至鏡檢結果為同一細胞形態后，將其接種于YPD固體培養基斜面上，恒溫培養48h后，于4℃保存備用。

1.3.2 酵母菌的生理生化特性鑒定

酵母菌分離菌株主要通過繁殖方式觀察、子囊孢子形成實驗、擲孢子形成實驗、菌絲形成實驗、葡萄糖產氣實驗、糖發酵實驗、脲酶分解實驗、產酯實驗、產酸實驗、無維生素生長實驗等生理生化特征進行鑒定[9-10]。

1.3.3 酵母菌的5.8S rDNA分析

1.3.3.1 酵母菌基因組DNA的提取

取1mL活化菌懸液，12000r/min離心1min，棄上清液，收集菌體；DNA的提取按照試劑盒說明書上的方法進行操作；然后將所提取的DNA于－20℃保存。

1.3.3.2 5.8S rDNA PCR擴增

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴增的模板，采用50μL反應體系，用一對與ITS序列互補的引物，ITS 1(5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇)和ITS 4(5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3＇)對5.8S-ITS區域酵母菌DNA進行擴增。PCR擴增體系：1μL酵母菌DNA，引物ITS 1和ITS 4各1μL，ddH2O 37μL，5μL的10×Buffer(含Mg2+)，4μL 的dNTP(超純)，0.25μL 的Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.75μL的雙蒸水。PCR擴增程序：98℃預變性10min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45min，從變性到延伸30個循環；72℃延伸10min；保溫4min。4℃暫時保存，－20℃保存備用。

PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓100V，電泳液為1×TAE。電泳后，用EB染色20min，紫外燈下觀察，拍照。

1.3.3.3 擴增產物測序和序列分析

5.8S rDNA擴增產物使用上海生工生物工程技術服務有限公司的UNIQ-10柱式PCR產物回收試劑盒，按說明回收、純化目的片段。經純度檢測后，委托上海生工生物工程技術有限公司進行測序，測得的序列與NCBI數據庫中一致序列進行比對及相似性分析。

1.3.3.4 系統發育分析

采用軟件DNA Star和MEGA 4.1，將測得的序列與GenBank數據庫中的相關種屬代表菌株的5.8S rDNA 基因序列進行系統發育分析。

2 結果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態及細胞形態特征

圖1 酵母菌的細胞形態Fig.1 Cell morphology of yeast

從新疆哈薩克族傳統自制酸馬奶中共分離出34株酵母菌，菌落形態呈圓形或橢圓形，表面光滑濕潤或粗糙，顏色呈乳白色或乳黃色，表面凸起，邊緣整齊或不規則，無性繁殖為芽殖或裂殖，細胞形態為圓、橢圓、卵圓等。

酵母菌在經YPD 培養基活化后，將制得的菌株在激光共聚焦顯微鏡及普通光學顯微鏡下，觀察細胞形態，結果見圖1，細胞形態符合酵母菌特征。

2.2 酵母菌分離株生理生化特性鑒定結果

采用傳統形態學、生理生化特性方法對酵母菌進行鑒定，鑒定結果為： Schizosaccharomyces 1株、Sehizoblastosporion 1株、Torulopsis 1株、Saccharomycodes 1株、Kloechera 9株、Kluveromyces 5株、Dekker 8株、Trichosporon 3株、Hansenula 2株、Brettanomyces 3株。根據《食品微生物實驗技術》[9]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[10]的方法，酵母菌種屬的鑒定結果見表1～4。

表1 酵母菌菌落形態及細胞形態特征鑒定結果Table 1 Description of colonial and cell morphology of isolated yeasts

表2 酵母菌生理生化特性鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical properties of isolated yeasts

表3 酵母菌糖發酵鑒定結果Table 3 Results of carbohydrate fermentation tests for identification of isolated yeasts

續表3

表4 酵母菌碳源、氮源同化鑒定結果Table 4 Results of carbon and nitrogen assimilation tests for identification of isolated yeasts

2.3 5.8S rDNA 分析

2.3.1 部分優勢酵母菌菌株5.8S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結果

對優勢酵母菌菌株進行分子生物學鑒定，通過PCR擴增該菌株的5.8S rDNA序列，用2%瓊脂糖凝膠對菌株的5.8S rDNA和ITS擴增產物做電泳檢測，溴化乙錠染色成像后，用凝膠成像分析系統進行拍攝，在750bp左右出現條帶，可初步鑒定為酵母菌，結果如圖2所示。

圖2 酵母菌菌株的5.8S rDNA PCR擴增后的電泳檢測圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of amplified products of 5.8S rDNA sequences from isolated yeasts

2.3.2 部分酵母菌菌株的5.8S rDNA片段測序及入庫比對結果

圖3 菌株12 5.8S rDNA序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of strain 12 and relative strains based on 5.8S rDNA sequence

圖4 菌株12的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 12

將擴增成功的酵母菌菌株的PCR產物送北京華大基因公司進行測序，在NCBI數據庫進行比對，選取序列最為接近的菌種。測序結果采用DNA Star軟件繪制系統發育進化樹，結果如圖3、4所示，菌株12與標準菌株(HQ396523.1)相似率為96%，為Kluyveromyces marxianus CHY1612菌。

3 結 論

本實驗從新疆哈薩克族傳統自制酸馬奶中分離純化、鑒定酵母菌菌株34株，共10個屬，分別為Schizosaccharomyces、Sehizoblastosporion、Torulopsis、Saccharomycodes、Kloechera、Kluveromyces、Dekker、Trichosporon、Hansenula、Brettanomyces。采用傳統鑒定方法對34株菌進行種屬鑒定，并對菌株12進行了5.8S rDNA序列分析。結果表明，雖然表型特征、生理生化特性是酵母菌分類的重要指標，但傳統分類方法用于準確鑒定酵母菌并不容易，通常需要大量的生理生化實驗[11-15]，采用5.8S rDNA分析鑒定酵母菌，準確率可達96%～99%。利用5.8S rDNA序列同源性分析和系統發育進化樹分析對菌株12進行了分子鑒定，鑒定結果為菌株12與標準菌株HQ396523.1同源性達到96%，與傳統生理生化特性鑒定結果一致。結果表明，5.8S rDNA序列分析應于酵母菌鑒定具有準確性高、重現性好、穩定性高、鑒定速度快的特點[12]，是一種區別、鑒定酵母菌很有效的方法[13-15]。

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Isolation and Identification of Yeasts from Koumiss as a Traditional Kazakh Fermented Drink in Xinjiang

LI Jing，JIA Jia-jia，YANG Yan，TIAN Yan，WU Yun.*...
(College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China)

In this study, 34 stains of yeasts were isolated from koumiss (a traditional fermented Kazakh drink in Xinjiang)sampled from Nanshan, Shuixigou and Zhaosu. According to the colonial morphology and biological properties, the strains were identified to consist of 1 stain of Schizosaccharomyces, 1 stain of Sehizoblastosporion, 1 stain of Torulopsis, 1 stain of Saccharomycodes, 9 stains of Kloechera, 5 stains of Kluyveromyces, 8 stains of Dekker, 3 stains of Trichosporon, 2 stains of Hansenula, and 3 stains of Brettanomyces. Strain 12 was further identified by 5.8S rDNA sequencing and phylogenetic tree analysis.The homology between the strain and Kluyveromyces marxianus was 96%. This was consistent with the results of identification based on morphological and biochemical properties, showing that yeast identification based on 5.8S rDNA sequences is accurate.

koumiss；yeast；isolation and identification；molecular biology

TS201.3

A

1002-6630(2012)05-0203-05

2011-10-30

國家公益性行業(農業)科研專項(200803033-A09011)；新疆維吾爾自治區科技支疆項目(201191238)；新疆維吾爾自治區重大專項(201130101-4)；新疆農業大學緊缺人才專業大學生創新項目

李靜(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：lijing_2010@sina.cn

武運(1965—)，女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術與食品安全。E-mail：wuyunster@sina.com