細莖石斛中抗氧化的有效成分研究

王玨 王鐵杰 殷果 王淑紅 魯藝 李曉帆

細莖石斛 Dendrobium moniliforme(Linn.).sw.為蘭科石仙桃屬植物，分布于我國的四川、湖南、廣西等地。其全草或假鱗莖可以入藥，具有清熱利濕、散風止痛之功效，在民間用于治療消化不良、癰瘡腫毒及風濕疼痛等疾病［1］。目前從石仙桃中分離得到的主要為三萜類成分［2］。在初步的活性篩選過程中，細莖石斛全草60%乙醇提取物顯示了出較好的抑制脂多糖(LPS)和干擾素-γ(IFN-γ)誘導的大鼠巨噬細胞(RAW264.7)一氧化氮(NO)生成的活性，即在終濃度為30μg/ml時抑制率為78.9%，且無細胞毒作用。因此筆者對其化學成分進行了研究，從細莖石斛干燥全草60%乙醇提取物中分離得到了6個化合物，根據理化常數和光譜分析鑒定其結構，分別為分別為 4，4’-二羥基-3，3’，5-三甲氧基-，’-二羰基二苯乙烯(1)，4，4'-二羥基-3，3'，5，α'-四甲氧基二苯乙烯(2)，4，4'，α'-三羥基-3，3'，5-三甲氧基二苯乙烯(3)，反式-3，5-二羥基-5-甲氧基二苯乙烯(4)，3，7-二羥基-2，4-二甲氧基菲(5)，毛蘭菲(6)，化合物1首次從該植物中分離得有效活性成分。利用體外測定大鼠巨噬細胞NO生成量的活性篩選方法測定了6化合物的活性，其中化合物2和3具有很好的抑制大鼠巨噬細胞NO生成的作用，化合物3，5和6有強于白藜蘆醇和蘆丁的DPPH自由基捕捉削去作用。

1 儀器與材料

紫外光譜用島津UV2401PC型紫外可見分光光度計測定(甲醇);紅外光譜用島津FT/IR-8400型傅立葉變換紅外光譜儀測定(KBr);HR-ESI-MS和ESI-MS分別用Micromass Q-TOF型和Bruker Esquire 2000型質譜儀測定;核磁共振光譜用Bruker Avance 400型核磁共振波譜儀測定，TMS為內標。薄層層析用硅膠G和色譜用硅膠(200-300目)為青島海洋化工廠生產。

2 提取與分離

細莖石斛全草2.3kg，60%乙醇回流提取2次，每次2小時，減壓回收乙醇得浸膏(270 g，11.7%)。將浸膏用水(3.0 L)分散，依次用石油醚(3.0 L×3)、乙酸乙酯(3.0 L×3)和正丁醇(3.0 L×3)進行萃取。石油醚部分(45.0 g)經過硅膠柱色譜，環己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到13個部份。Fr.10(10 g)經 Sephadex LH-20 柱色譜，甲醇-水(60∶40)為洗脫劑，然后經ODS中低壓柱色譜，以甲醇-水(50∶50，70∶70)洗脫，再經制備 HPLC［甲醇-水(47∶53)，10 ml/min，275 nm］純化得到化合物 4(11.4 mg)，2(50.6 mg)和6(14.4 mg)。Fr.7-4 經 ODS 柱色譜，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脫，再經制備 HPLC［甲醇-水(38∶62)，10 ml/min，220 nm］純化得到化合物5(17.4 mg);Fr.7-5經ODS柱色譜，甲醇-水(40∶60，50∶50)洗脫，再經制備 HPLC［甲醇-水(42∶58)，10 ml/min，220 nm］純化得到化合物1(6.8 mg)，3(5.8 mg)。

3 抑制大鼠巨噬細胞NO生成的活性測試

取大鼠巨噬細胞樣細胞系(RAW 264.7)細胞，以1.2×106個/ml的濃度，每孔 200μL接種在 96孔板(SumitomoBakelite，#8096R，Tokyo)中，在 37°C 下培養 2 h。然后將0.4 μl供試品(終濃度:3 μM，10μM，30μM，100μM)與 2 μL LPS(終濃度:100ng/ml)和2 μL INF-γ(終濃度:0.33 ng/ml)一同加入到細胞液中，共同在37°C下培養16 h，之后將細胞液迅速冷卻。取上清液按照每孔100μL置于新的96孔板中，接著在每孔中加入50μL的Griess試劑。室溫下放置10 min后，用酶標儀在550nm測定反應產物的吸收值，并扣除在630nm測定的背景吸收值。在同一塊96孔板中，同時加入NaNOa的標準溶液用以計算NO-2濃度的標準曲線，以未加細胞、LPS、INF-γ和供試品的細胞培養液作為空白，以未加樣品的細胞液作為陰性對照，以白藜蘆醇(resveratrol)作為陽性對照。用MTT法測試細胞毒作用。NO抑制率=［(A陰性對照組-A實驗組)/A陰性對照組)］×100%。(實驗結果見表1)

表1 化合物體外抑制大鼠巨噬細胞NO生成的試驗及DPPH自由基清除作用結果

4 DPPH自由基清除作用測試

參照文獻實驗方法并加以改進，將不同濃度的供試品溶液100μL和2×10-4M DPPH·溶液100μL加入96孔板各孔中，同時以不加DPPH·的供試品溶液各濃度作為對照以消除供試品本身顏色對測試結果的干擾，并設DPPH·陰性對照(以100μL無水乙醇代替供試品)，每組平行設4個復孔。將96孔板放入酶標儀中，震蕩1 min，并于此條件下保存(室溫、避光)，30 min后測試其在517 nm處的吸光度OD值，按如下公式計算供試品的自由基清除率。自由基清除率=［ODDPPH·陰性對照組-(OD實驗組-OD實驗組乙醇對值)］/ODDPPH·陰性對照組×100%(實驗結果見表1)

5 結論

隨著對自由基研究的逐漸深入，人們認識到自由基與衰老、癌癥、心腦血管疾病和炎癥等的發生與發展密切相關一氧化氮(NO)和DPPH都是自由基及抗氧化活性的常用試劑。NO及DPPH參與許多生理和病理過程，巨噬細胞在IL-1、IL-2、TNF、IFN等細胞因子和內毒素(如LPS)的誘導下可以產生大量的NO，同時NO上調又可以使巨噬細胞釋放炎癥性細胞因子，如TNF-α、IL-la和rIFN等。這些因子對機體既起到介導炎癥的作用，又起到細胞生長分化的調節作用。巨噬細胞在細胞內、外環境變化時可通過NO產生免疫保護、免疫損傷和免疫調節作用。

本實驗利用體外抑制大鼠巨噬細胞NO生成的活性測試體系，對從細莖石斛中分離得到的6個化合物進行了活性測定，結果表明化合物1、2和3具有很好的NO生成的抑制作用，活性好、于陽性對照白藜蘆醇和蘆丁，并且沒有細胞毒作用。化合物3，5和6具有很好的DPPH自由基捕捉削去能力，化合物5和6活性結果好于陽性對照白藜蘆醇和蘆丁一倍左右。該結果提示細莖石斛中的抗炎抗氧化活性成分可能為芐類及其衍生化合物。

［1］Jiangsu New Medical College.Dictionary of Chinese Materia Medica(中藥大詞典).Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Publishers，1986.

［2］Ma X M，Li M F，Zhang Q R.Chemical constitutes of Yunnan Pholidota(Pholidota yunnnanesis).Zhongcaoyao(中草藥)，1995，26(2):59-61.