局部應用A-NK/IL-2治療的抑瘤作用

高君 王志華 于德水 辛穎 丁穎

我們對A-NK及NA-NK細胞體外擴增情況進行觀察，然后用A-NK/IL-2局部或全身應用進行體內(nèi)的抗腫瘤治療實驗，并與NA-NK進行了比較。結果局部應用A-NK/IL-2治療比NA-NK/IL-2有更強的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和培養(yǎng)液

1.1.1 完全培養(yǎng)液(CM) 分離制備的A-NK和NA-NK細胞均采用RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.1.2 重組IL-2 南京軍事醫(yī)學研究所研制10萬IU/2 ml所用25 cm2和75 cm2培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均為美國Costar產(chǎn)品。

1.2 腫瘤細胞 惡性纖維肉瘤S180(腹水型)，由本實驗室反復傳代而建立，皮下接種于昆明純系小白鼠;

1.3 實驗動物 昆明純系小白鼠，本研究所動物室傳代和繁殖，6～8周齡雌性，平均體重16～18 g;嚴格按照國際標準進行飼養(yǎng)和實驗操作。

1.4 小鼠脾細胞分離和制備A-NK和NA-NK細胞 按照Hegenaars 98年的方法，無菌取鼠脾，過200目鋼網(wǎng)，研磨成單細胞懸液，將所得單細胞懸液加入尼龍毛柱中，在37℃5%C02培養(yǎng)箱中孵育45 min，以去除B細胞和單核巨噬細胞。用預溫37℃的完全培養(yǎng)液輕輕沖洗尼龍毛柱，收集未粘附尼龍毛的細胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)成2×106/ml，置于塑料培養(yǎng)瓶中水平培養(yǎng)24 h后，移去含未粘附塑料表面的細胞懸液(此即NA-NK細胞)，收集粘附于塑料表面的細胞(即A-NK細胞)，二者分別重懸于含50%自體條件培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)擴增。

1.5 細胞體外擴增情況的觀察 將A-NK或NA-NK細胞以1×106/ml的深度加入6孔板，2 ml/孔，設三個復孔，定期換液，每隔三天計數(shù)一次，取三孔均值。

以0.4%臺盼蘭(Trypan Blue)活細胞計數(shù)法計數(shù)細胞數(shù)量，以1:l比例將臺盼蘭與單個細胞懸液混和，室溫中放置2 min，加入到細胞計數(shù)板中，鏡下觀察細胞活力和進行細胞計數(shù)，活細胞不著色，死細胞染成蘭色。

公式如下:

1.6 腫瘤細胞動物接種 荷瘤小鼠待腫瘤長至1～3 cm(14 d左右)，斷頸處死。無菌條件下取出皮下腫瘤，生理鹽水沖洗后，將腫瘤組織剪碎研磨，過鋼網(wǎng)濾過。離心(1000rpm，5 min)去上清，生理鹽水稀釋為單細胞懸液，光鏡下計數(shù)，稀釋至1×106個/ml。用l ml注射器吸取腫瘤細胞混懸液0.2 ml(2×105個細胞)，注射至每只小鼠背部皮下，待腫瘤可以觸及，進入實驗。

1.7 A-NK體內(nèi)抗腫瘤實驗 昆明小白鼠皮下接種Sl80惡性纖維肉瘤細胞1×105/只，荷瘤3 d后分別給每個小鼠局部注射IL-2 1000pIU/只/天，荷瘤5 d后將小白鼠隨機分為四組，每組10只，I組為空白對照，Ⅱ組為A-NK/IL-2尾靜脈注射(全身治療)，Ⅲ組為NA-NK/IL-2局部注射，IV組為ANK/IL-2局部注射組。治療組效應細胞數(shù)為5×106/只/次。

1.8 統(tǒng)計學方法 依據(jù)數(shù)據(jù)性質的不同，分別采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 A-NK與NA-NK體外擴增情況 如表1所示。A-NK在第10天達到增殖高峰，NA-NK于第7天達到增殖高峰。A-NK細胞增加16.08倍，NA-NK細胞增加3.36倍。在整個培養(yǎng)過程中，A-NK擴增指數(shù)均高于NA-NK。

表1 A-NK與NA-NK增殖情況的比較

2.2 局部注射效應細胞的抗腫瘤作用和對照組相比，局部注射組(Ⅲ組和IV組)有明顯的抑制腫瘤生長的作用(P＜0.05)，尾靜脈注射組(Ⅱ組)治療效果不明顯(P＞0.05)，其中A-NK比NA-NK的抑瘤效果更明顯。

表2 A-NK與NA-NK局部注射的抗腫瘤作用

3 討論

本次實驗證明A-NK體外擴增指數(shù)高于NA-NK。A-NK細胞具有較高的體外增殖能力和細胞毒活性，并且能夠浸潤到實體瘤內(nèi)部殺傷腫瘤細胞，是非常有潛力的理想的效應細胞。白細胞介素2(IL-2)是一種由133個氨基酸組成的糖蛋白，通過T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞表面的受體而起作用。IL-2可增加殺傷性淋巴細胞毒性，誘導淋巴因子激活的殺傷細胞的生成，促進B細胞增生和分泌免疫球蛋白，誘導其他細胞因子如白細胞介素1、白細胞介素6等的分泌［1］。本實驗說明:局部應用A-NK/IL-2細胞比NA-NK/IL-2細胞有更強的抑瘤作用，A-NK局部注射是行之有效的給藥途徑，并可減少IL-2全身應用產(chǎn)生的巨大副作用。以LAK/IL-2為基礎的生物療法對實體瘤的治療效果很大程度上取決于LAK細胞在腫瘤部位的聚集能力。A-NK也不例外。A-NK細胞是外周血NK細胞的一小部分(4% ～30%)，由于具有高水平的增殖能力和細胞毒性以及獨特的功能特點，現(xiàn)在已經(jīng)日益受到研究人員的重視，如何獲得足量供常規(guī)治療用的高細胞毒活性的免疫效應細胞是過繼免疫療法需要解決的重要問題之一。

［1］王志華，等.腫瘤細胞因子治療.中國免疫學雜志，2001，22(3):33-35.