大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究

吳海霞

(寧波鎮海龍賽醫院，浙江寧波315200)

大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究

吳海霞

(寧波鎮海龍賽醫院，浙江寧波315200)

目的優選D-101大孔樹脂精制杭白菊總黃酮工藝中的最佳上樣條件。方法將影響樹脂吸附性能的3個因素上樣量、流速和pH設計成3因素3水平試驗，采用L9(34)表正交試驗，以樹脂吸附總黃酮含量、乙醇洗脫總黃酮含量和固體總黃酮含量為評價指標，選擇最佳條件。結果確定最佳上樣條件為上樣量20 mL、pH為5、流速2 BV/h。結論該最佳上樣條件可應用于大孔樹脂精制杭白菊總黃酮的上樣條件研究。

杭白菊;總黃酮;正交試驗法;上樣條件;大孔樹脂

杭白菊Chrysanthemum morifolium Ramat;是一種常用中藥，產于浙江桐鄉、海寧、嘉興等地，為“浙八味”之一，具有散風清熱、平肝明目的功效，用于風熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花［1］。還可抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抗艾滋病［4］、治療心血管病［5-6］。杭白菊含有多種揮發油、黃酮(香葉木素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、香葉木素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖苷、金合歡素-7-O-β-D葡萄糖苷［7］)、菊苷等成分。現代藥理研究表明，杭白菊揮發油解熱、總黃酮降壓是其散風清熱、平肝明目的藥理學基礎之一［8］。因此，揮發油和總黃酮是其發揮藥效作用的主要有效成分。為了提高杭白菊總黃酮的提取率，筆者采用正交試驗設計，以杭白菊總黃酮含量為評價指標，優選出杭白菊總黃酮的最佳上樣條件。現報道如下。

1 儀器與試藥

D-101大孔樹脂(安徽三星樹脂科技有限公司，批號為100807);BS110型萬分之一天平(北京賽多利天平有限公司); SKS200H超聲儀(華南超聲設備廠);RE-52型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-2型數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);UV-VIS 8500型紫外可見分光光度計(天津市拓普儀器有限公司)。菊花(浙江中醫藥大學中藥飲片廠);蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所);其他化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 溶液制備

精密稱取蘆丁對照品15;3 mg，轉入100 mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得0;153 0 mg/mL蘆丁對照品溶液。取杭白菊30 g精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中。加入16倍量、90%的乙醇。回流提取4次，每次1;5 h。每次提取前冷浸30 min，最后合并濾液，即得樣品溶液。

2．2 標準曲線制備

精密吸取蘆丁對照品溶液1，3，5，7，9，11 mL，分別置25 mL容量瓶中，各加入30%乙醇至12;5 mL，加入0;7 mL NaNO2 (1∶20)，搖勻，放置5 min后加入0;7 mL Al(NO3)2(1∶10)，6 min后再加入5 mL 1 mol/L的NaOH溶液，混勻，用30%乙醇稀釋至刻度，混勻，以相應試劑作空白，10 min后于516 nm波長處測定吸光度，以質量濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=8;840 9 C-0;001 3，r=0;999 8 (n=6)。

2．3 總黃酮測定

精密吸取樣品溶液0;5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加10% Al(NO3)2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應試劑作為空白，在516 nm波長處測定各溶液吸光度，由標準曲線計算出樣品中總黃酮含量。精密吸取洗脫液10 mL于已恒重的燒杯內，蒸干，放入58℃恒溫干燥箱內，烘干至恒重。計算固體總黃酮含量。

2．4 正交試驗設計

選擇樣品上樣量(因素A，mL)、pH(因素B)、洗脫流速(因素C，BV/h)3個因素，進行正交試驗(表1)。以吸附率、洗脫率、總固物含量為考察指標進行考察。

表1 正交試驗因素水平表

2．5 D－101樹脂的吸附、洗脫試驗

取10 mL選定樹脂，加95%乙醇浸泡過夜，傾去乙醇，加蒸餾水20 mL，三角燒瓶外作標記，浸泡1 h，重復多次至基本無醇味。將處理過的樹脂濕法上柱，原柱中有5 mL蒸餾水，注意不要攪拌，用吸管，動作輕，防止樹脂變細。然后，放出蒸餾水至液面高出柱床1 mm，用蒸餾水再洗1 BV，摸索流速。按表1所示上樣條件進行上樣吸附，收集流出液。用蒸餾水洗脫至HCL-Mg反應陽性，再用40%乙醇進行洗脫至洗脫液無色，并收集洗脫液。利用紫外分光光度法測定流出液和洗脫液的吸光度，根據標準曲線計算出濃度。按吸附率=(C樣品液-C流出液)/C樣品液× 100%，洗脫率=C洗脫液×25/［(C樣品液-C流出液)×25］×100%，計算結果。

2．6 正交試驗設計與結果

杭白菊總黃酮提取正交試驗中各因素和水平之間的9種組合方式及每組結果見表2，方差分析結果見表3、表4、表5。可見，從吸附率結果可知A1B1C3為最佳吸附條件，從洗脫率和總固物率可見A3B1C3為最佳條件。從各個方差分析發現，對吸附率而言，因素A并沒有顯著性差異，從表3中也可看出各個A值的K1，K2，K3之間相差不大，故最佳條件為A3B1C3。

表2 正交試驗設計及結果

表3 吸附率方差分析結果

表4 洗脫率方差分析結果

表5 總固物方差分析結果

2．7 驗證試驗

根據正交試驗設計結果，采用最佳上樣條件，按2;5項下進行驗證試驗，重復3次，結果見表6。可見，RSD遠小于3%，準確度很高。

表6 驗證試驗結果

3 討論

根據正交試驗設計發現，隨著樣品上樣量的增加，樹脂對樣品的吸附率降低。在一定上樣量條件下，吸附率隨流速的增加而降低。樣品溶液的pH對吸附也有較大影響，但無明顯的規律性。結果表明，紫外-可見分光光度法測定杭白菊總黃酮的含量操作簡便，結果準確可靠。最佳上樣條件為A3B1C3，即上樣量20 mL、pH=5、流速2 BV/h。從洗脫率的方差分析可知，各個因素對洗脫率并沒有顯著性的影響，可以推斷這個指標的選擇對試驗結果沒有意義，以后進一步研究杭白菊總黃酮時應考慮是否選更具代表性的指標。由驗證試驗結果可知，3次試驗結果明顯優于其他9組試驗，說明該最佳上樣條件穩定可行，可用于大孔樹脂精制杭白菊總黃酮。

［1］國家藥典委員會;中華人民共和國藥典(一部)［M］;北京:中國醫藥科技出版社，2010:292;

［2］張爾賢，方黎，張捷，等;菊花提取物的抗氧化活性研究［J］;食品科學，2000，21(7):6 291;

［3］Wang HK，Xia Y，Yang ZY，et al;Recent advances in the discovery and evelop-ment of flavonoids and their analogues as antitumor and anti-HIV agents［J］;Adv Exp Med Bio，1998，439:191-225;

［4］Hu CQ，Chen K，Shi Q，et al;Anti-AIDS agents，10'acacetin-7-O-β-D-galactopy-ranoside，an anti-HIV principle from Chrysanthe-mum morifolium and a structure-activity correlation with some related flavoids［J］;J Nat Prod，1994，57(1):422-511;

［5］浙江醫科大學生理學教研組;菊花制劑對冠脈作用的實驗研究［J］;浙江醫科大學學報，1978，7(4):52-58;

［6］楊學運，孫孔富，奚毓妹，等;中藥杭白菊酚性部分的藥理作用探討［J］;浙江醫科大學學報，1989，18(6):28-31;

［7］賈凌云，孫啟時，黃順旺;滁菊花中黃酮類化學成分的分離與鑒定［J］;中國藥物化學雜志，2003，13(3):159-161;

［8］戴敏，劉青云，李道中，等;菊花解熱、降壓作用的物質基礎研究［J］;中藥材，2001，24(7):505-506;

Study on Sampling Conditions of Refining Chrysanthemum Total Flavonoids with Macroporous Resin

Wu Haixia
(Zhenhai District Longsai Hospital，Ningbo，Zhejiang，China315200)

ObjectiveTo optimize D-101 macroporous resin for obtaining the best sampling conditions to refine chrysanthemum total flavonoids;Methods3 factors influencing resin adsorption ability，the sample volume，flow rate and sample solution pH value，were designed to the 3 factors 3 levels test;Adopting the L9(34)table orthogonal experiment，the total flavonoid content by resin adsorption，total flavonoids content by ethanol eluting and solid total flavonoid content were used as the evaluation indexes for screening the best conditions;ResultsThe best optimum sampling conditions were A3B1C3，i;e;，the sample volume of 20 mL，pH 5 and thevelocity of 2 BV/h; ConclusionThe best sampling conditions can be used in the sampling condition study for refining chrysanthemum total flavonoids by macroporous resin;

chrysanthemum;total flavonoids;orthogonal test;sampling condition;macroporous resin

TQ461;R284．2;R284．1

A

1006-4931(2012)14-0067-03

2011-10-28)