m iR-34a通過調控YY1抑制腎癌細胞的增殖及侵襲

王明麗， 李 智， 徐晉豫， 翁文浩， 許閃閃

(同濟大學附屬上海市第十人民醫院檢驗科，上海 200072)

m iR-34a通過調控YY1抑制腎癌細胞的增殖及侵襲

王明麗， 李 智， 徐晉豫， 翁文浩， 許閃閃

(同濟大學附屬上海市第十人民醫院檢驗科，上海 200072)

目的 探討miR-34a在腎癌組織中表達、miR-34a對人腎癌ACHN細胞增殖和侵襲的影響及調控機制。方法 實時聚合酶鏈反應(PCR)檢測miR-34a在20例腎癌及癌旁組織中的表達;采用脂質體轉染法將miR-34amimics轉染入腎癌ACHN細胞中，試驗分空白對照組、陰性對照組、miR-34amimics轉染組。實時PCR檢測轉染24 h后miR-34a表達量;噻唑藍(MTT)試驗檢測細胞增殖;流式細胞術檢測細胞周期;Transwell及Matrigel檢測細胞侵襲能力;實時PCR和蛋白質印跡(Western blot)技術檢測轉染后轉錄因子YY1表達水平。結果 與癌旁組織相比，20例癌組織中miR-34a平均表達量為1．06±0．67，顯著低于癌旁組織(1．62±0．83，P＜0．01);轉染后24 h，miR-34a mimics轉染組的 miR-34a表達量為157．04±13．01，較陰性對照組顯著上調(P＜0．01);miR-34amimics轉染組細胞增殖能力顯著降低(P＜0．01)，細胞生長被阻滯在G0/G1期;細胞侵襲能力明顯減弱(P＜0．01);轉染miR-34amimics后YY1基因在mRNA表達無明顯變化(P＞0．05)，蛋白水平下調。結論 miR-34a在腎癌中低表達，可能與腎癌的發生有關;miR-34a調控YY1的表達可能是抑制腎癌細胞生物活性的重要機制之一。

miR-34a;YY1;細胞增殖;侵襲;腎癌

腎癌占成人惡性腫瘤的2% ～3%，其中以腎透明細胞癌最多見［1］。由于腎透明細胞癌對化療、放療均不敏感，免疫治療也難以取得理想效果，基因治療已成為研究的熱點。

microRNA是一種長約22個核苷酸的小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列 RNA。自2002年 Calin等［2］首次報道microRNA異常與腫瘤相關后，越來越多的研究顯示microRNA參于腫瘤細胞發育、分化、凋亡和增殖等的調控，在腫瘤發生和發展中起重要作用。miR-34a是一個進化保守的microRNA家族miR-34中的一員，編碼基因位于染色體1p36。有文獻報道稱miR-34a在人類胰腺癌、結腸癌、神經母細胞瘤等眾多惡性腫瘤中表達下調或缺失［3-5］，并認為其低表達促進腫瘤的發生。本研究觀察miR-34a在腎透明細胞癌組織中的表達情況，并使用miR-34a模擬物(miR-34a mimics)轉染腎癌細胞株ACHN，觀察miR-34a對細胞增殖、侵襲能力的影響。由于通過軟件預測得知轉錄因子YY1是miR-34a的靶基因，本研究進一步分析了其對YY1的調控機制。

材料和方法

一、材料

人腎癌細胞株 ACHN(ATCC號:CRL-1611TM)由上海市第十人民醫院泌尿外科惠贈;DMEM培養液和胎牛血清購自Hyclone公司和Gibco公司;逆轉錄和實時聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自TAKARA公司;LiPofectamine2000脂質體轉染試劑和Trizol購自美國 Invitrogen公司;兔抗人YY1單克隆抗體購自Epitomics公司;人miR-34amimics、microRNA 陰性對照(miR Negative Control)由廣州銳博生物公司合成;實時 PCR引物由上海生物工程有限公司合成，采用莖環法設計miR-34a和內參U6 RNA的逆轉錄和PCR的引物;普通基因PCR以18S作為內源性參照，見表1;Transwell小室購自BD公司;Matrigel購自Sigma公司。

二、腎癌標本miR-34a表達水平檢測

標本取自上海市第十人民醫院2008至2010年間手術切除的20例腎透明細胞癌及對應的癌旁組織，所有標本于液氮凍存。Trizol裂解組織標本，抽提總RNA，逆轉錄獲得各標本 cDNA。取2μL cDNA為模板，加入 18μL PCR反應液［4μmol/L基因引物1μL，2×高靈敏DNA熒光染料(SYBR)Premix Ex Taq 10μL，紅色熒光染料ROX Dye(陽性參比信號，50×)0．4 μL，雙蒸水(ddH2O)6．6μL］。在 ABI 7900實時熒光定量PCR儀上進行擴增，反應條件為:95℃ 預變性1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40 個

循

環，72℃ 5 min。

表1 PCR引物序列、產物長度

三、細胞培養及轉染

ACHN細胞貼壁生長于DMEM培養液，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱中。轉染前1天將細胞以2×105個/孔接種于6孔板中，于24 h內當細胞融合達40% ～60%時進行轉染。采用陽離子脂質體 LiPofectamine 2000按試劑盒操作說明進行轉染，試驗分3組:空白對照組(只加脂質體)、陰性對照組、miR-34a mimics轉染組。

四、熒光定量PCR檢測轉染前后miR-34a表達

Trizol提取各試驗組轉染24 h后細胞總RNA，逆轉錄獲得各標本cDNA。熒光定量PCR，以U6作為內參，反應條件同上。

五、細胞增殖能力檢測

轉染5 h后消化細胞以1 000個/孔的密度接種于96孔板上，每孔補足200μL培養基。各試驗組每組設5個復孔。轉染1、2、3和4 d后每孔加入20μL噻唑藍(MTT)，孵育4 h，吸棄原液加入150μL二甲基亞砜(DMSO)震蕩10 min，酶標儀檢測490 nm波長處的吸光度(A)值，各組求均值做生長曲線。

六、流式細胞術檢測細胞周期的變化

取至少105個轉染24 h后的各組細胞，離心棄去上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，1×Binding buffer重懸細胞，加入碘化丙錠(PI)5 μL，去 RNA 酶 1．25 μL，裂解液(NP40)0．25μL后檢測細胞周期。

七、細胞侵襲遷移能力檢測

1．Transwell遷移試驗 轉染5 h后消化細胞，以含0．1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM培養液重懸細胞，5×104個/小室接種于Transwell上室中，補足培養基至100μL，下室為500μL完全培養基，20 h后取出將上室內面擦凈，乙醇固定，結晶紫染色，清洗，拍照。33%冰醋酸溶解細胞，酶標儀檢測A573nm值。

2．Matrigel侵襲試驗 50μL Matrigel包被Transwell小室，37℃ 1 h。轉染5 h后消化細胞，以含0．1%BSA的DMEM培養液重懸細胞，1×105個/小室接種于上室中，最終保持上室內100μL培養基，24 h后，按Transwell試驗進行后續操作。

八、熒光定量 PCR、蛋白質印跡(Western blot)技術檢測YY1 mRNA及蛋白表達

Trizol提取各試驗組轉染48 h后細胞總RNA，逆轉錄獲得各標本cDNA后進行PCR擴增。以18S為內參，反應條件同上。轉染48 h后，抽提總蛋白，進行蛋白定量、電泳、轉膜、封閉。加入兔抗人YY1抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，再加入IRye700×標記的羊抗兔和IRye800×標記的羊抗鼠IgG抗體(1∶1 000)孵育后，以β-actin為內參，用ODYSSEY數字顯像系統采集信號。

九、統計學方法

應用SPSS 17．0軟件包對試驗數據進行統計，試驗結果以ˉx±s表示，組織標本結果經對數轉換后采用配對t檢驗比較組間miR-34a水平的差異，單因素方差分析和q檢驗做多組間及兩兩比較。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

一、腎癌及癌旁組織標本miR-34a表達情況

經實時PCR擴增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對定量的方法計算 miR-34a與 U6拷貝數的比值，數據經對數轉換后比較癌旁組和腎癌組之間的差異，20例腎癌組織標本中miR-34a的表達量為 1．06±0．67，明顯低于癌旁組織(1．62 ±0．83)，差異有統計學意義(t=6．87，P ＜0．01)。見圖 1。

二、轉染miR-34amimics后miR-34a表達變化

圖1 腎癌及癌旁組織miR-34a的表達

經實時PCR擴增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對定量的方法計算 miR-34a與 U6拷貝數的比值，比較試驗組和對照組之間的差異，以陰性對照組miR-34a表達量為1，miR-34amicmics轉染組表達量為157．04±13．01，2組差異有統計學意義(t=20．768，P ＜0．01);而空白對照組為1．10±0．17，與陰性對照組間差異無統計學意義(t=1．01，P ＞0．05)。

三、細胞增殖能力的變化

細胞增殖曲線顯示，miR-34a mimics轉染組細胞增殖速度明顯降低，轉染后1、2、3、4 d細胞生長抑制率［(1－AmiR-34a/A陰性對照)×100%］分別為9%、25%、37%和50%，以轉染后4 d最高，與陰性對照組比較差異有統計學意義(t=40．53，P＜0．01)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統計學意義(t=0．76，P ＞0．05)。見圖2。

圖2 miR-34amimics對ACHN細胞增殖的影響

四、流式細胞術檢測轉染后細胞周期的變化

轉染miR-34amimics后，處于G0/G1期細胞數百分比增多，陰性對照組為 31．82±0．97，與miR-34a組(42．87±0．40)相比差異有統計學意義(t=18．19，P ＜0．01)，空白對照組為 33．94 ±1．62，與陰性對照組組間差異無統計學意義(t=1．95，P ＞0．05)。見圖3。

五、細胞遷移及侵襲能力的改變

轉染 miR-34a mimics后，miR-34a組(0．08±0．004)的細胞穿過小室膜的細胞數較陰性對照組(0．168±0．003)減少，差異有統計學意義(t=26．2，P ＜0．01)。空白對照組(0．63 ±0．005)與陰性對照組比較則差異無統計學意義(t=1．31，P＞0．05)。見圖4、5。

圖3 轉染miR-34amimics對ACHN細胞周期的影響

圖4 轉染miR-34amimics對ACHN細胞遷移能力的影響(200×)

圖5 冰醋酸溶解后細胞A值

轉染 miR-34amimics后，miR-34a組(0．11 ±0．007)穿過Matrigel基質膠的細胞數較陰性對照組(0．18±0．005)明顯減少，差異有統計學意義(t=12．45，P ＜0．01)，空白對照組(0．17 ±0．005)與陰性對照組則差異無統計學意義(t=1．04，P ＞0．05)。見圖 6、7。

六、轉染后YY1 mRNA水平及蛋白水平變化

圖6 轉染miR-34amimics對ACHN細胞侵襲能力的影響(200×)

圖7 冰醋酸溶解后細胞A值

經實時PCR擴增得到各目的基因的Ct值，以2-△△Ct相對定量的方法計算各基因與18 S拷貝數的比值，比較試驗組和對照組之間的差異。結果顯示轉染48 h后，YY1 mRNA水平無明顯變化，空白對照組為 1．22±0．089，與陰性對照組(1．0 ±0．015)相比差異無統計學意義(t=3．18，P＞0．05)。陰性對照組與 miR-34a組(0．96±0．043)相比差異也無統計學意義(t=0．98，P＞0．05)。Western blot結果顯示，轉染 48 h 后，YY1蛋白表達水平明顯降低。見圖8、9。

圖8 轉染miR-34amimics后YY1 mRNA表達的變化

圖9 轉染miR-34amimics后YY1蛋白水平的變化

討 論

腎癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤，其治療以外科手術切除為主，但這給晚期腎癌的治療帶來一定的困難［1］。近年來對基因治療的應用研究逐漸成為腎癌新療法的研究熱點。目前已有多種基因治療方案在臨床上得到初步應用，同時研究人員仍在不斷找尋新的治療基因。而microRNA的發現無疑為腫瘤基因治療注入了新的活力。

microRNA通過抑制其靶基因，在腫瘤的發生發展、增殖、凋亡、耐藥以及轉移等方面均發揮著重要作用，有可能成為腫瘤治療的新靶點。50%以上的microRNA編碼基因位于與癌癥有關的基因區或脆性位點內。在多種類型腫瘤細胞系和腫瘤中均可以檢測到microRNA的異常表達。miR-34a的CPG島甲基化沉默在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、胰腺癌等多種細胞系中存在［6］，這表明miR-34a的失活可能與多種腫瘤的發生、發展相關，提示其在上述腫瘤中發揮作用。目前對于miR-34a在腎癌細胞中的功能鮮有報道。因此，研究miR-34a在腎癌中的功能并進一步探索其作用機制有重要意義。

miR-34a在腎癌中的表達如何?是否也參與腎癌的發生和發展?本試驗結果顯示，與癌旁組織相比，miR-34a在腎癌中呈低表達，表明miR-34a的低表達可能在腎癌發生和發展中起一定作用。最新研究證明在膠質瘤細胞U251中miR-34a充當著重要的抑癌基因的角色［7］。在腎癌中miR-34a是否也有著同樣重要的作用，本研究通過直接瞬時轉染microRNA mimics對miR-34a功能進行了檢測，該法的優點在于化學合成microRNA簡單、快捷，可避免構建表達載體的步驟，從而有效提高了特定microRNA的表達。本研究將miR-34amimics轉染入ACHN細胞內，使miR-34a在腎癌細胞中表達上調，并發現轉染后細胞增殖明顯受抑，這種抑制效應在轉染后1～2 d顯現，并持續4 d以上，且細胞被阻滯于G0/G1期，有絲分裂受到抑制，說明miR-34a在促進細胞生長分化方面可能起重要作用。本研究結果還顯示，miR-34amimics轉染組中細胞侵襲遷移能力明顯減弱，提示miR-34amimics抑制細胞侵襲能力。

我們通過 mirBase、TargetScan和 PicTar等生物信息學網站分析miR-34a可能的靶基因，且Chen等［8］已通過熒光素酶報告系統證實YY1是miR-34a的直接靶基因，miR-34a直接與YY1的3'非編碼區結合來調控其翻譯。YY1具有促進腫瘤細胞增殖、分化和轉移的作用，在前列腺癌、膀胱癌、宮頸癌、骨肉瘤等腫瘤中都顯著高表達，揭示了YY1在腫瘤發展中的重要作用［9-10］。其在腎癌中的功能目前未見報道，本課題組前期工作證實了YY1在腎癌細胞中扮演癌基因的作用。利用Western blot技術，本研究檢測出轉染miR-34amimics后ACHN細胞YY1蛋白表達量明顯降低，而mRNA水平無明顯變化，提示在腎癌細胞中miR-34a是在轉錄后水平對YY1進行調控，進而起到抑癌的作用。

綜上所述，本試驗初步觀察到miR-34a的低表達可能是腎癌發生中的重要事件，在腎癌發生和發展過程中可能具有重要作用，并初步顯示了miR-34a的抑癌作用有可能部分地通過調控YY1來實現。miR-34a有望成為腎癌的診斷和進展的分子標志物，也可能是腎癌基因治療的一個有效靶點。然而，包括YY1在內的這些靶基因及具體、精確的作用機制還有待于進一步的研究。

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The inhibition of cell proliferation and invasion through m iR-34a regulating YY1 in human renal carcinoma cell

WANGMingli，LIZhi，XU Jinyu，WENGWenhao，XU Shanshan． (Department of Clinical Laboratory，the Tenth

People's Hospital of Tongji University，Shanghai200072，China)

Objective To investigate miR-34a expression in renal carcinoma cell and the inhibitory effect and regulatingmechanism ofmiR-34a on the proliferation and invasion in human renal carcinoma ACHN cells．M ethods The expressions ofmiR-34a in cancer and pericancerous tissues were detected by real-time polymerase chain reaction(PCR)．ACHN cells were transfected with miR-34amimics and there set blank control group，negative control group and miR-34amimics group．The expression ofmiR-34awasmeasured by real-time PCR 24 h after transfection．The cell proliferation and cell cyclewere determined by 5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)and flow cytometry．The invasive ability was examined by Transwell and Matrigel invasive assays．ThemRNA and protein levels of YY1 were detected by real-time PCR and Western blot．Results The relative expression ofmiR-34a in cancer tissues(1．06 ±0．67)was significantly lower than that in pericancerous tissues(1．62 ±0．83，P ＜0．01)．After transfection 24 h，an increase expression of miR-34a was noted in miR-34a mimics group(157．04 ± 13．01)comparing with negative control group(P ＜0．01)．Overexpression ofmiR-34a significantly inhibited the cell proliferation(P ＜0．01)．The cell cycle was arrested at G0/G1phases．Transwell and Matrigel invasive assays showed that the invasive ability of cellswas significantly suppressed after transfection(P ＜0．01)．YY1 gene had nomRNA expressions after transfection(P ＞ 0．05)．Conclusions The expression of miR-34a is low in renal carcinoma，and it may be correlated with tumorigenesis，partially through regulating YY1．

miR-34a;YY1;Cell proliferation;Invasion;Renal carcinoma

2012-02-09)

(本文編輯:范基農)

1673-8640(2012)08-0635-06

Q503

A

王明麗，女，1984年生，技師，主要從事分子生物學檢驗工作。通

訊作者:李 智，聯系電話:021-66306831。