清胰湯對急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表達的影響

王念林 張鐵英 歐陽玉霞 楊元生 陳墾

·短篇論著·

清胰湯對急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表達的影響

王念林 張鐵英 歐陽玉霞 楊元生 陳墾

急性胰腺炎(AP)為臨床常見病，病情兇險，常引起全身炎癥反應綜合征(SIRS)，并最終導致多器官功能衰竭(MODS)。目前具體發病機制尚不明確，治療仍以對癥支持為主。因而探求AP發病機制對尋找有效的治療方法意義重大。本研究觀察清胰湯對AP大鼠胰腺NF-κB p65表達的影響。

一、材料與方法

1．實驗動物分組：54只SD大鼠由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2008-0002，雌雄不限，體重(200±10)g。按完全隨機法分成對照組、AP組、清胰湯組。采用逆行胰膽管注射3%牛磺膽酸鈉的方法[1]建立AP模型。清胰湯組于建模后立刻予清胰湯1 ml/100 g體重灌胃，每12 h給藥一次；對照組僅開腹翻動胰腺數次即關腹，以生理鹽水替代灌胃。

2．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α測定：血清淀粉酶測定采用人工碘比色法；血清IL-1和TNF-α檢測采用ELISA方法。

3．胰腺病理學檢查及NF-κB p65檢測：胰腺組織常規病理檢查，盲法閱片，并根據Ozhan等[2]標準評分。胞質和(或)胞核呈黃色或棕黃色為陽性。高倍鏡下隨機取5個視野，計陽性細胞數百分比及染色強度。陽性細胞數：<5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；無染色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。兩評分乘積0～1分為(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>6分(+++)。

二、結果

1．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平： AP組和清胰湯組血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平均高于對照組；AP組血清淀粉酶水平于24 h達到峰值，隨后逐漸下降，予清胰湯治療后，24 h和48 h血清淀粉酶明顯降低，72 h后3組比較差異無統計學意義；清胰湯組血清IL-1和TNF-α較AP組明顯降低，呈時效依賴性，以72 h下降最明顯(表1)。

表1 各組血清淀粉酶、IL-1和TNF-α變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

2．胰腺病理組織學變化：對照組胰腺組織未見病理改變(圖1a)；AP組大鼠胰腺可見出血、壞死，大量炎細胞浸潤，腺泡結構模糊，部分腺泡胞核溶解或消失，殘余腺泡腫脹，間質水腫(圖1b)；而清胰湯組胰腺組織病理改變較AP組減輕(圖1c)。各組胰腺病理評分見表2。

圖1對照組(a)、AP組(b)和清胰湯組(c)大鼠胰腺組織病理改變(HE ×200)

表2 各組胰腺病理評分

注：與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

3．胰腺NF-κB p65蛋白表達：對照組胰腺組織NF-κB p65微量表達，主要見于細胞質，呈淺黃色(圖2a)；AP組各時間點NF-κB p65表達增強，呈棕黃色，部分細胞核也有表達(圖2b)；清胰湯組胰腺腺泡染色較AP變淺，胰腺NF-κB p65免疫組化積分較AP明顯降低(圖2c，表3)。

圖2 對照組(a)、AP組(b)和清胰湯組(c)胰腺NF-κB表達(×200)

表3 各組胰腺NF-κB p65免疫組化積分

注：與AP組比較，aP<0.05

討論AP病程中氧自由基、白介素、TNF等細胞因子大量產生，并易導致SIRS和MODS。清胰湯為傳統組方，具有通里攻下，減少腸源性感染與內毒素血癥；活血化瘀，改善微循環，減輕各器官的缺血、缺氧，減少氧自由基的產生；清除氧自由基；抑制體內各種炎癥因子的產生；誘導器官細胞凋亡，從而減輕器官壞死程度等作用[3]。本研究結果顯示，應用清胰湯治療后AP大鼠各種氧化應激因子、炎癥因子明顯降低，器官損傷程度改善。

研究發現[4]，TNF-α、IL-1等多種細胞因子及黏附分子在基因多肽水平上受到NF-κB p65調節。活化的NF-κB p65可單獨或與其他轉錄因子協同參與上述炎癥因子基因的誘導表達，在細胞因子瀑布樣級聯反應中起中心作用。在AP發生早期，多個器官可檢測到NF-κB p65高表達，并參與多器官的病理損傷[5]。應用NF-κB p65活化選擇性抑制劑NBD，可選擇性靶向抑制NF-κB，明顯減輕AP大鼠胰腺、肺等器官損傷[6]。近年研究發現[7-8]，活性氧ROS是激活NF-κB的重要中介分子，因此抗氧化劑作為NF-κB抑制劑被深入研究。

本實驗再次驗證了清胰湯在AP模型大鼠中顯示出良好的治療效果。與AP組比較，清胰湯24 h和48 h血清淀粉酶明顯降低，72 h接近正常水平，提示清胰湯能有效降低血清淀粉酶。炎癥介質TNF-α、IL-1在AP發生、發展過程中發揮著重要作用，本研究發現二者升高明顯。應用清胰湯治療后大鼠血清TNF-α、IL-1水平于48 h和72 h較AP組下降明顯，提示清胰湯可抑制炎癥反應，減少炎癥介質的產生和釋放。本結果顯示，AP大鼠胰腺NF-κB p65表達在建模后有不同程度升高，與血清中TNF-α、IL-1升高及胰腺病理損傷相平行，應用清胰湯灌胃治療，降低了血清TNF-α、IL-1水平，并下調胰腺NF-κB p65的表達，改善其病理損傷。

綜上所述，中藥清胰湯對AP的治療是通過多靶點作用實現的 ，其可能機制是通過抑制炎癥通路中炎癥相關蛋白的表達，從而達到保護器官目的。本研究得出，AP發生、發展涉及NF-κB p65等炎癥相關因子的激活，產生并釋放過度炎癥介質介導過度炎癥反應造成各器官的損傷；清胰湯可抑制AP大鼠體內過度炎癥反應，降低TNF-α、IL-1水平，下調胰腺NF-κB p65表達，從而起到保護胰腺的治療效果。

[1] 王念林，陳墾，龍友明，等.核因子-κB在大鼠急性壞死性胰腺炎中作用的實驗研究.胰腺病學，2005,5：93-96.

[2] Ozhan G, Yanar HT, Ertekin C, et al. Polymorphisms in tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) gene in patients with acute pancreatitis. Mediators Inflamm, 2010, 2010:482950.

[3] Yang DY, Duan SB, Aili JT. Effect of qingyi decoction in treating severe acute pancreatitis and its impacts on blood level of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-8. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009, 29:1122-1124.

[4] Viterbo D, Bluth MH, Mueller CM, et al. Mutational characterization of pancreatitis-assiociated protein 2 domains involved in mediating cytokine secretion in macrophages and the NF-kappaB pathway. J Immunol, 2008, 181:1959-1968.

[5] Wang YL, Zheng YJ, Zhang ZP, et al. Effects of gut barrier dysfunction and NF-kappaB activation on aggravating mechanism of severe acute pancteatitis. J Dig Dis, 2009,10:30-40.

[6] Long YM, Chen K, Liu XJ, et al. Cell-permeable Tat-NBD peptide attenuates rat pancreatitis and acinus cell inflammation response. World J Gastroenterol, 2009, 15:561-569.

[7] KanSH,Huang F,Tang J,et al.role of intrapulmonary expression of inducible Nitric oxide synthase gene and nuclear factor kappaB activation in severe pancreatitis-assosiated lung injury. Inflammation,2010,33:287-294.

[8] Szabolcs A, Biczó G,Rakonczay Z, et al.simultaneous proteosome inhibition and heat shock protein induction by bortezomib is beneficial experimental pancreatitis. Eur J Pharmacol,2009,616:270-274.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.019

2010年廣州市花都區醫藥衛生科技計劃項目(HD10WSY17)

510800 廣東廣州，廣州市花都區人民醫院消化內科(王念林、張鐵英、歐陽玉霞)；廣東藥學院附屬第一醫院消化內科(楊元生、陳墾)

陳墾Email:chken@gdpc.edu.cn

2011-02-22)

(本文編輯：屠振興)