6-BA對黑麥草愈傷組織誘導影響的初步研究

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(湖南農業大學農學院草業科學系，湖南長沙 410128)

6-BA對黑麥草愈傷組織誘導影響的初步研究

吳蓮蓉，徐慶國*，李洪，武羿君，黃萍，張婷，趙鑫，李斌，高偉

(湖南農業大學農學院草業科學系，湖南長沙 410128)

為了確立最佳的黑麥草再生體系，選用多年生黑麥草雅晴、沃土和一年生黑麥草特高等3個不同黑麥草品種的成熟種子為外植體，分別采用CC，MS，NB，N6等4種基本培養基，在每種培養基中分別加入5 mg/L的2,4-D和0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5種濃度的6-BA進行愈傷組織誘導。結果表明：在6-BA濃度為0.05 mg/L時，黑麥草各品種愈傷組織的誘導率最高；在相同濃度6-BA作用下，不同黑麥草品種間愈傷組織誘導率存在顯著的品種間差異；不同基本培養基對黑麥草愈傷組織的誘導率也存在影響，4種供試基本培養基中，以CC基本培養基的黑麥草愈傷組織誘導率最高。

黑麥草；愈傷組織；6-BA

黑麥草(Lolium L.)屬禾本科黑麥草屬植物,原產于歐洲西南部、北非及亞洲西南部，栽培歷史悠久。現已成為世界溫帶地區最重要的禾本科牧草[1]，具有生長快、分蘗多、耐牧、綠色期長和葉片光滑柔軟、色澤美麗等優點[2]。在我國長江以北的溫帶地區，黑麥草是最重要的草種之一,對人工草地建植十分重要,是很有潛力的種質資源[3，4],在長江以南的亞熱帶和熱帶地區也經常與其它草種混播,廣泛應用于公共綠地、家庭庭院、運動場和高爾夫球場的建設[3～7]。但因其越夏難、高溫高濕條件下易發生病害、高溫環境下需水量大等問題,限制了其在城市綠地和牧草種植中的應用。國內外多年來一直致力于通過組織培養及遺傳轉化技術對黑麥草進行遺傳改良[8～10],并獲得了轉基因植株，但是還沒有轉基因抗高溫節水型黑麥草品種應用于草業生產。對黑麥草進行遺傳轉化,第一步要建立其愈傷組織再生體系，而作為建立高頻再生體系的前提和基礎,愈傷組織的誘導非常關鍵[17，18]，高質量的愈傷組織是進一步誘導分化和生根的前提和基礎[19]。

目前國內研究普遍認為以黑麥草成熟種子為外植體，在所用的愈傷誘導培養基中加入2，4-D(濃度為5 mg/L)誘導效果最佳,但誘導愈傷組織培養基中是否有必要加入分裂素(例如6-芐氨基嘌呤，6-BA)還不確定[11]。徐定炎等[12]通過實驗表明，以6-BA濃度為0 mg/L時，黑麥草成熟種子愈傷組織誘導率最高；李雪等[13]通過實驗認為，6-BA濃度對黑麥草成熟種子愈傷組織誘導率影響不顯著；杜雪玲等[14]通過實驗表明，在2,4-D為5 mg/L,6-BA為0.05 mg/L時,黑麥草各品種愈傷組織的質量和誘導率最高；陳季琴等[15]通過實驗認為，2,4-D濃度在5 mg/L,6-BA濃度在0.025 mg/L或0.2 mg/L有利于黑麥草成熟種子誘導產生愈傷組織；楊茹等[16]通過實驗認為，6-BA濃度為0.1 mg/L時有利于多年生黑麥草成熟種子誘導產生愈傷組織。因此，草坪草組織培養條件和植株再生頻率的影響因素依然是一個亟待研究的重要課題[20]。本研究選取不同黑麥草成熟種子為外植體，研究不同濃度6-BA對黑麥草愈傷組織誘導的影響，并試圖找到能產生高出愈率的黑麥草基因型(品種)、6-BA最佳濃度和最佳基本培養基，為黑麥草遺傳轉化打下基礎，還有可能篩選耐高溫節水型黑麥草無性變異系，為我國草業生產和黑麥草育種提供優良的種質資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗選用北京百綠(天津)國際草業有限公司提供的多年生黑麥草雅晴、沃土和一年生黑麥草特高等3個黑麥草品種的成熟種子作為外植體材料。

1.2 外植體消毒方法

先將3個黑麥草品種的種子用無菌水浸泡2 h，然后用70%酒精處理30 s,無菌水沖洗3次，再用升汞處理15 min，無菌水沖洗6次。經過處理的種子即可用于接種。

1.3 培養基

采用MS，N6，CC和NB等4種基本培養基，分別加5 mg/L的2，4-D，再分別加0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5種濃度的6-BA，共設置了16種不同的培養基組合。調節各培養基的pH至5.8。

1.4 愈傷組織誘導

將經過消毒處理的3個黑麥草品種的種子接種到不同培養基組合,每個培養皿接種30粒種子,每個培養基組合設置3次重復,置于25～26℃、暗培養條件下進行愈傷組織誘導培養。

1.5 愈傷組織觀察及記錄

不同品種的黑麥草種子消毒后，分別接種于誘導愈傷組織的不同培養基組合中，接種7 d后開始統計種子的發芽率和出愈率，每隔5 d統計1次，記錄數據。按如下公式和標準記錄各處理的發芽率和出愈率：

發芽率(%)=發芽種子數/接種數×100

為解決加濕器啟停帶來的溫濕度慣性，加濕器保持預熱狀態。當室內環境濕度需求變化時，根據PID控制算法，SCR可控硅加濕器無級調節輸出精確的加熱量。

出愈率(%)=愈傷組織不再變化后的愈傷組織塊數/接種數×100

1.6 數據統計與分析方法

對各組培處理的發芽率、出愈率等數據，采用Excel統計分析軟件分別進行統計分析和顯著性測驗。

2 結果與分析

2.1 不同6-BA濃度對黑麥草出愈率的影響

將經過消毒處理的3個黑麥草品種的種子接種到不同培養基組合,分別進行暗培養1周后，黑麥草種子開始發芽，最終發芽率的統計結果表明(表1)，不同濃度的6-BA對黑麥草的發芽率影響不明顯，且黑麥草的發芽率對其愈傷組織出愈率影響也不明顯。因此，黑麥草的發芽率與6-BA的濃度相關不明顯，與其出愈率也無相關。

如表1所示，不同處理的黑麥草組織培養材料暗培養20 d后開始出現淡黃色的愈傷組織；40 d后統計不同處理組合的愈傷組織誘導率結果，不同濃度的6-BA處理，其黑麥草愈傷組織的誘導率不同。5種6-BA濃度處理中，0.05 mg/L的出愈率為42.1%,極顯著高于其他濃度處理的出愈率；0 mg/L和0.1 mg/L處理的出愈率分別極顯著高于0.2 mg/L和0.4 mg/L的處理。由此說明，在一定的濃度范圍內，6-BA能夠提高黑麥草愈傷組織的出愈率，但濃度過高反而會降低黑麥草組織培養的出愈率。

表1 不同6-BA濃度處理的黑麥草發芽率與出愈率

注：表中不同小寫字母表示α=0.05水平上差異顯著,不同大寫字母表示α=0.01水平上差異極顯著。下同。

2.2 黑麥草品種對愈傷組織誘導的影響

表2 不同品種的黑麥草發芽率與出愈率

從表2可知，不同黑麥草品種的發芽率差異不顯著，以沃土發芽率最高，但其出愈率卻最低，由此表明不同黑麥草品種的發芽率與其出愈率無關。不同黑麥草品種的愈傷組織誘導率不同，其中，特高的出愈率為34.9%，極顯著高于其他兩個黑麥草品種的出愈率；而雅晴與沃土的出愈率差異未達顯著水平。

2.3 不同基本培養基對黑麥草愈傷組織誘導的影響

如表3所示，不同基本培養基的黑麥草種子暗培養1周后，種子開始發芽，不同基本培養基對黑麥草的發芽率影響不明顯，并且，發芽率對不同基本培養基的黑麥草出愈率影響也不明顯。結果表明，黑麥草的發芽率與基本培養基不存在明顯的相關，與其出愈率也不相關。

不同基本培養基的黑麥草暗培養20 d后開始出現淡黃色的愈傷組織。40 d后對愈傷組織誘導率統計，結果表明：CC基本培養基的出愈率為42.2%,極顯著高于其他3種基本培養基；N6基本培養基的出愈率最低，僅為15.5%。不同基本培養基的出愈率大小依次為CC>MS>NB>N6。由此可知，黑麥草愈傷組織誘導的最佳基本培養基是CC培養基。

表3 不同基本培養基的黑麥草發芽率與出愈率

3 討 論

3.1 6-BA濃度對黑麥草愈傷組織誘導的影響

研究表明，黑麥草的愈傷誘導過程中，2,4-D濃度為5 mg/L時，在一定的范圍內，加入不同濃度的6-BA，黑麥草的愈傷組織誘導率有所提高。如采用CC基本培養基，黑麥草品種特高在6-BA濃度為0 mg/L時，出愈率為51.1%，濃度為0.05 mg/L時，出愈率為67.8%，提高了16.7%。但隨著6-BA濃度的繼續增加，其出愈率反而明顯下降。這與杜雪玲等人的研究結果一致[18]。但與其他人的結論有差別，可能與所用的黑麥草品種有關，還需做進一步的研究。

3.2 影響黑麥草愈傷組織誘導的因素

提高愈傷組織誘導率是建立植物組織培養再生體系的第一步,沒有高頻的誘導率,便無法得到大量的、高質量的愈傷組織,其隨后的分化及生根便難以進行。

試驗表明，在一定的6-BA濃度范圍內，能夠提高黑麥草愈傷組織的出愈率，這說明6-BA對愈傷組織誘導有促進作用。黑麥草愈傷組織誘導率存在顯著的品種間差異，可能與品種遺傳基因型差異有關。本研究結果表明，CC培養基為最適宜的基本培養基,可能是因為CC培養基中添加了0.2 mol/L濃度的甘露醇,這可使該培養基維持在一個較高的滲透壓環境下，這種環境可能有利于黑麥草愈傷組織中內源細胞分裂素和脫落酸含量的提高,而這些激素含量的提高有利于促進黑麥草體細胞胚胎的形成。

3.3 最佳黑麥草愈傷組織誘導條件組合的選擇

試驗分析表明，不同6-BA濃度與不同黑麥草品種對黑麥草愈傷組織的出愈率均有極顯著的影響，而6-BA濃度與不同黑麥草品種之間的互作不顯著。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導條件的最佳水平組合為：6-BA濃度為0.05 mg/L與黑麥草特高品種的組合。

試驗分析表明，不同6-BA濃度與不同基本培養基對黑麥草愈傷組織出愈數均有極顯著影響，而6-BA濃度與不同基本培養基之間的互作不顯著。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導條件的最佳水平組合為：6-BA濃度為0.05 mg/L與CC培養基的組合。

試驗分析表明，不同黑麥草品種與不同基本培養基對黑麥草愈傷組織出愈數的差異未達顯著水平，而且，黑麥草品種與基本培養基之間的互作也未達顯著水平。通過多重比較，篩選出黑麥草愈傷組織誘導條件的最佳水平組合為：黑麥草品種特高與CC培養基的組合。

綜上所述，通過不同6-BA濃度、不同黑麥草品種、不同培養基兩兩間的分析，最后篩選出黑麥草愈傷組織誘導的最佳組合為：0.05 mg/L的6-BA濃度+黑麥草品種特高+CC基本培養基。

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PreliminaryStudiesonEffectsof6-BAonCallusInductioninRyegrass

WULian-rong,XUQing-guo*,LIHong,WUYi-jun,HUANGPing,ZHANGTing,ZHAOXin,LIBin,GAOWei

(Department of Grassland Science, College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

The mature seeds of three different ryegrass cultivars, perennial ryegrass Yatsyn and Pandora, and annual ryegrass Tetragold, were selected as explants, four types medium of CC, MS, NB, N6 were used, 5 mg/L of 2, 4-D and different concentration of 6-BA were added to each medium to study the callus induction in order to establish the regeneration system of ryegrass. The results showed that the callus induction rate of 3 ryegrass cultivars was highest when the concentration of 6-BA was 0.05mg/L. Under the same concentration of 6-BA, the callus induction rate existed significant differences among different ryegrass varieties. There existed effect of different basic medium on ryegrass callus induction rate, and the ryegrass callus induction rate was highest in CC treatment.

Ryegrass; Callus; 6-BA

吳蓮蓉(1990-)，女，湖南邵陽人。*通訊作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南農業大學大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目；中國科學院植物種質創新與特色農業重點實驗室開放課題(Y052811t04)；湖南省科技廳項目(2010NK3014與10077)。

S543+.601

A

1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.