蛇毒PCA改善冠脈微血栓大鼠血液流變學的機制研究*

李 曙， 張根葆,2 △， 洪 云， 陸曉華

(皖南醫學院 1病理生理學教研室， 2蛇毒研究所， 3弋磯山醫院超聲醫學科，4機能實驗中心，安徽 蕪湖 241002)

1000-4718(2012)04-0595-06

2011-11-23

2012-02-24

安徽省高等學校省級自然科學研究項目(No.KJ2010B461)；安徽省教育廳自然基金重點項目 (No.KJ2011266)；皖南醫學院中青年課題(No.WK200918)

△通訊作者 Tel：0553-3932435；E-mail: zgb858@163.com

蛇毒PCA改善冠脈微血栓大鼠血液流變學的機制研究*

李 曙1， 張根葆1,2 △， 洪 云3， 陸曉華4

(皖南醫學院1病理生理學教研室，2蛇毒研究所，3弋磯山醫院超聲醫學科，4機能實驗中心，安徽 蕪湖 241002)

目的探討皖南產蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(PCA)改善冠脈微血栓(CAM)大鼠血液流變學的作用機制。方法Sprague-Dawley大鼠50只，隨機分為假手術組、CAM組、低、中、高劑量PCA[CAM+PCA(0.5 mg/kg)、CAM+PCA (2 mg/kg)、CAM+PCA (8 mg/kg)]干預組，每組10只。通過從主動脈根部直接向左心室注入月桂酸鈉1.0 mg/kg(濃度10 g/L)以建立大鼠冠脈微血栓模型，采用血栓彈力儀系統(TEG)描計血栓彈力圖，測定各組血漿中內皮素-1(ET-1)、P-選擇素(P-selectin)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)的水平；Western blotting檢測心肌組織中P-selectin和腫瘤壞死因子α(TNF-α)蛋白表達；光鏡觀察心肌組織學改變。結果與模型組比較，PCA大劑量干預組凝血時間和血凝塊形成時間延長，Alpha角度、最大幅度和血凝指數值減小(P<0.05)，血漿CK-MB、LDH、AST、ET-1和P-selectin的水平降低(P<0.05)，心肌組織P-selectin和TNF-α的蛋白表達下降(P<0.05)。病理觀察顯示中、高劑量PCA干預組大鼠冠脈未形成微血栓。結論蝮蛇毒PCA組分可以限制冠脈微血栓的形成，降低血漿ET-1和P-selectin的含量，抑制心肌組織P-selectin和TNF-α表達，改善微血栓后血液流變學變化，有效保護心肌細胞。

蝮蛇毒; 蛋白C激活物； 微血栓； 血液流變學

血栓性疾病是一組因各種原因致使血液在血管內或心臟中，由流動的液體變為凝固的固體，致使血流發生不同程度的受阻后所形成的綜合病癥[1-2]。蛇毒作為一種天然的藥用資源，含有多種活性成分，是目前治療心腦血管疾病較為有效的生物制劑。近些年來，本課題組從皖南地區五步蛇、蝮蛇和眼鏡蛇粗毒中分離純化了蛋白C激活物(protein C activator, PCA)，實驗研究已證實該生物活性物質可影響凝血過程，影響血小板黏附、聚集和保護血管內皮細胞功能，具有高效低毒的抗凝、溶栓效應，這對于臨床血栓性疾病的防治以及改善血液高凝狀態具有重要意義。但PCA是否通過抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)防止內皮損傷和血栓形成目前尚未見報道。本文采用月桂酸鈉復制大鼠冠脈微血栓(coronary artery microthrombosis,CAM)模型，探討PCA對實驗性冠脈微血栓的影響，為今后進一步臨床應用提供科學的實驗依據。

材 料 和 方 法

1藥物與試劑

蛇毒PCA由皖南醫學院蛇毒研究所提供；SDS-PAGE凝膠電泳試劑(Sigma)；P-選擇素(P-selectin)、TNF-α、羊抗大鼠多克隆抗體、馬抗山羊 IgG抗體、β-actin (Santa Cruz)，月桂酸鈉(上海潤捷化學試劑有限公司)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，內皮素-1(endothelin-1, ET-1) 測定試劑盒(北京尚柏生物科技有限公司)，其余試劑均為國產分析純。

2主要儀器

TEG?5000型血栓彈力儀系統(Haemoscope Corporation)；DYY-10C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；蛋白質純化系統(KTAprime，GE)；DW-2000型動物人工呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司)；Model 680型酶標儀(Bio-Rad)；7060 型全自動生化分析儀(日立)；Western blotting：Bio-Rad MiniGel系統。

3動物分組與給藥

健康雄性Sprague-Dawley大鼠50只,體重200～250 g，由皖南醫學院實驗動物中心提供。大鼠隨機分為假手術組 (sham operation,sham)、CAM模型組、低、中、高劑量PCA干預組(0.5 mg/kg、2 mg/kg、

8 mg/kg),每組10只。模型復制10 min后，各PCA組舌靜脈注射PCA；CAM組注射同體積生理鹽水；sham組不復制微血栓模型，僅注射同體積生理鹽水。

4大鼠冠脈微血栓模型制備

參考葉明芳等[3]方法加以改進，取SD雄性大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)后，仰臥固定，常規頸部手術，氣管插管，呼吸機輔助通氣，左前外側中心切口進胸，分離主動脈并用血管夾夾閉主動脈后，迅速以微量注射器從主動脈根部注入月桂酸鈉1.0 mg/kg(濃度10 g/L)；夾閉20 s后，松開血管夾，心跳穩定后逐層關胸。

5大鼠血液流變學監測

各實驗組動物均于3 h后頸總動脈取1 mL血液置于3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝劑5 mL試管中，實驗所用玻璃試管均經硅化處理。血樣加入專業測試杯，激活劑為Kolin。用TEG?5000型血栓彈力圖-凝血彈性描記儀系統(簡稱TEG)對血樣各參數：凝血時間(R)；血凝塊形成時間(K)；Alpha角度；最大幅度(maximum amplitude,MA)；凝血指數(coagulation index,CI)等進行檢測。

6大鼠血液生化及分子生物學指標檢測

采用7060 型全自動生化分析儀連續檢測法測定血漿中CK-MB、LDH和AST活性。采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法原理定量測定ET-1和P-選擇素水平，嚴格按試劑盒說明書操作。

7Westernblotting檢測

術后12 h處死動物，取約1 g心肌，加組織裂解液，勻漿、超聲、離心(12 000×g離心5 min)，取上清液150 μg用10% SDS-PAGE電泳后半干式轉膜至 PVDF膜, 5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。P-selectin、TNF-αⅠ抗(1∶250稀釋 )室溫過夜, 加辣根過氧化物酶標記的馬抗山羊IgG抗體 (1∶5 000稀釋 )室溫反應 1.5 h, 洗膜后DAB顯色,膜置濾紙上干燥, 以β- actin為內參照，進行半定量分析。

8組織形態學觀察

取左心室乳頭肌經10%中性甲醛溶液固定，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察微血栓形成及心肌形態學變化。

9統計學處理

結 果

1蝮蛇毒PCA組分對大鼠血栓彈力圖影響

CAM組較sham組，R值和K值明顯降低(P<0.05)，表明CAM組血液處于高凝狀態；除CAM+PCA(0.5 mg/kg)組外，其它組與CAM組比較，R值、K值和CI明顯增加(P<0.05)，高劑量(8 mg/kg)組與sham組比較無明顯差異(P>0.05)，表明血液高凝狀態有所緩解，見圖1、表1。

Figure 1. Thrombelastogram performance in the blood of different rats.A:TEG parameters;B: sham；C: CAM；D: CAM+PCA (8 mg/kg).

圖1不同組大鼠血液血栓彈力圖表現

表1 蝮蛇毒PCA組分對大鼠血栓彈力圖的影響

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

2蝮蛇毒PCA組分對大鼠血漿中心肌酶水平的影響

CAM組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性均較sham組顯著升高(P<0.05)； PCA中劑量組和高劑量組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性較CAM組顯著降低(P<0.05)； PCA低劑量組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB活性與CAM組無明顯差異(P>0.05)。這提示中、高劑量蛇毒PCA對冠脈微血栓造成的心肌細胞損傷有一定的保護作用，見表2。

表2 PCA對各組大鼠血漿中AST、LDH和CK-MB水平的影響

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

3蝮蛇毒PCA組分對大鼠血漿中P-selectin和ET-1含量的影響

CAM組大鼠血漿中P-selectin和ET-1含量較sham組顯著升高(P<0.01)； PCA中劑量組和高劑量組大鼠血漿中P-selectin和ET-1的含量較CAM組顯著降低(P<0.05)；PCA低劑量組大鼠血漿中P-selectin和ET-1的含量與CAM組無明顯差異(P>0.05),見表3。

4蝮蛇毒PCA組分對大鼠冠脈微血栓形成的影響

CAM組和PCA低劑量組心肌病理切片顯示：微血管腔內有微血栓形成、炎癥細胞附壁、心肌腫脹。Sham組、PCA中劑量組和高劑量組心肌病理切片顯示：微血管腔內有大量紅細胞、無炎癥細胞附壁、無心肌腫脹,見圖2。上述結果表明，蝮蛇毒PCA能有效抗凝、溶栓及保護心肌細胞。

表3PCA對各組大鼠血漿中P-選擇素和ET-1含量的影響

GroupP-selectin(μg/L)ET-1(ng/L)Sham11.23±1.21174.11±15.91CAM37.01±2.01*227.41±21.11*CAM+PCA(0.5mg/kg)35.89±2.14229.07±20.57CAM+PCA(2mg/kg)20.29±2.09#210.57±16.33#CAM+PCA(8mg/kg)16.09±2.34##183.68±11.02##

*P<0.05vssham;#P<0.05,##P<0.01vsCAM.

Figure 2. Comparison of myocardium in different groups of rats(HE staining,×400). A: sham; B: CAM; C: CAM+PCA(0.5 mg/kg); D: CAM+PCA(2 mg/kg); E: CAM+PCA(8 mg/kg).

圖2不同組大鼠心肌病理切片比較

5蝮蛇毒PCA組分對心肌中TNF-α和P-選擇素含量的影響

與sham組比較，CAM組大鼠心肌中TNF-α和P-selectin含量明顯增加(P<0.05)。PCA中、高劑量組大鼠心肌TNF-α和P-selectin含量較CAM組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

討 論

冠狀動脈血栓性疾病是心室重構和心力衰竭的常見原因，其中微血栓的形成是造成冠脈微循環障礙的主要因素。實驗中月桂酸鈉制造的外周動脈血栓模型依靠月桂酸鈉有強烈的內皮損傷作用，可造成內皮的脫落，甚至穿孔；觸發炎癥性介質如腫瘤壞死因子、白細胞介素、黏附分子等的釋放，觸發血小板活化[4-5]。聚集成血小板血栓并阻塞遠端血管而形成冠狀動脈微血栓。

蛇毒是從毒蛇毒腺中分泌出來的一種液體，其成份十分復雜，主要含有多種酶、蛋白質和多肽等生物活性大分子。眾多研究已經表明，從蛇毒粗毒中提取的活性分子具有非常廣泛的藥理學作用，部分已應用于臨床止血、抗凝、鎮痛、抗腫瘤等領域。近年來我室從蝮蛇毒中提取的蛋白C激活物被實驗證明可影響凝血過程、影響血小板黏附、聚集和保護血管內皮細胞功能，具有高效低毒的抗凝、溶栓效應[6-7]。

實驗發現,PCA組大鼠心肌酶較模型組有明顯改善，表明經PCA治療，大鼠心肌損傷減輕。在血栓彈力儀監測模型組及PCA干預組時，發現PCA干預組的R值、K值較模型組明顯增大，CI減小；同時病理切片顯示，PCA干預組的心肌細胞形態正常，組織間水腫和炎癥反應較輕，微血管內未形成微血栓，而模型組的心肌細胞水腫和炎癥反應明顯，微血管內有微血栓形成，也可看到微小梗死病灶，通過檢測內皮損傷物ET-1也顯示PCA干預后的大鼠血漿中ET-1含量明顯低于模型組，提示PCA可能通過抑制血栓的形成而改善血液流變學對心肌起保護作用。

圖3各組大鼠心肌中TNF-α和P-selectin的含量

研究提示，炎癥網絡機制在血栓的形成起著重要作用。TNF-α是一種重要的炎癥細胞因子，能促進炎癥細胞如中性粒細胞、單核細胞等黏附至內皮細胞。選擇素家族是重要的黏附分子，TNF-α能迅速刺激這類黏附分子的合成和表達。其中P-選擇素是存在于內皮細胞Weibel-Palade(WP)小體和血小板a顆粒中的一種糖蛋白。當血管內皮損傷及TNF-α刺激時，儲存于內皮細胞WP小體內的P選擇素可通過出胞作用迅速轉移至質膜上[8]，介導中性粒細胞減速并沿血管壁滾動[9]。Juliana 等[10]在腫瘤壞死因子誘導中性粒細胞聚集實驗中證實，在敲除內皮細胞P-選擇素大鼠模型中, TNF-α誘導的白細胞聚集、黏附現象較野生鼠中的減輕，因此血管內炎性反應是通過TNF-α介導內皮細胞釋放P-selectin而啟動，并導致內皮功能紊亂, 進一步促進血小板活化[11]。Mami等[12]和Ishikawa 等[13]研究顯示血小板的聚集、黏附需要以白細胞向內皮遷移、黏附為前提，因此內皮細胞Ps 參與介導血小板在管腔內的聚集和黏附。

本研究中以蝮蛇毒PCA干預月桂酸鈉損傷的CAM模型，Western blotting結果顯示，大鼠心肌中P-選擇素和TNF-α的表達較模型組明顯降低，與病理結果相符。提示PCA可能通過調控TNF-α和P-selectin表達抑制白細胞及血小板的聚集、黏附，減輕血栓的形成，從而改善冠脈微血栓后的血液流變學變化。

綜上所述，我室提取的蝮蛇毒PCA活性物質能明顯抑制微血栓形成，減少心肌酶釋放，改變血液的高凝狀態，對缺血心肌和血管內皮有改善和保護作用，其機制可能是通過抑制炎癥反應和血小板活化，改善血管內皮細胞功能，也可能是通過減輕微血管栓塞改善心肌損傷。因此，明確蝮蛇毒PCA調節血液流變學改變的主要途徑，是我們進一步研究的方向[14-17]。

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AgkistrodonhalysvenomPCAimproveshemorheologyinratswithcoronaryarterymicrothrombosis

LI Shu1, ZHANG Gen-bao1,2, HONG Yun3, LU Xiao-hua4

(1DepartmentofPathophysiology,2InstituteofSnakeVenom,3DepartmentofUltrasonography,YijishanHospital,4ExperimentalCenterforFunctionalSubjects,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:zgb858@163.com)

AIM: To explore the effect of protein C activator (PCA) from WannanAgkistrodonhalysvenom on hemorheology in the rats with coronary artery microthrombosis(CAM).METHODSFifty SD rats were randomly divided into sham operation group, CAM group, low dose (0.5 mg/kg), medium dose (2 mg/kg ) and high dose (8 mg/kg) of PCA treatment groups. The model of CAM was induced by injecting sodium laurate at dose of 1.0 mg/kg with the concentration of 10 g/L from aortic root to left ventricle. Thrombelastogram was obtained by thromboelastography instrument system. The content of endothelin-1(ET-1) and P-selectin, and the activity of creatine kinase-MB (CK-MB),lactate dehydrogenase (LDH) and aspartate aminotransferase (AST) in plasma were determined by ELISA. The protein expression of myocardial P-selectin and TNF-α was detected by Western blotting. The structural changes of the myocardial cells and interstitial tissues were observed under microscope.RESULTSCompared with CAM group, clotting time and clot formation time significantly prolonged in high-dose PCA group. The alpha angle, maximum amplitude, coagulation index, and the levels of ET-1, P-selectin, CK-MB, LDH and AST in plasma were decreased. The protein expression levels of P-selectin and TNF-α in myocardial tissues were down-regulated (P<0.05). Cardiac histological observation showed that coronary microthrombi in medium-dose and high-dose PCA groups were not found.CONCLUSIONAgkistrodonhalysvenom PCA inhibits the formation of coronary microthrombi, down-regulates the expression of P-selectin and TNF-α, improves the abnormal hemorheology after microthrombi, and effectively protects myocardial cells.

Agkistrodonhalysvenom; Protein C activator; Microthrombus; Hemorheology

R543.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.004