CGRP通過抑制TNF-α介導單磷酰脂A對大鼠小腸的預適應延遲保護作用*

楊彩紅， 張軒萍， 梁月琴， 李 焰， 郝一彬

(山西醫科大學1藥理教研室，2機能實驗室，山西 太原 030001)

1000-4718(2012)04-0669-06

2011-10-21

2012-02-13

山西醫科大學博士啟動基金資助項目(No.03201102)

△通訊作者 Tel: 0351-4135079; E-mail: tyyangxiaoluo@163.com

CGRP通過抑制TNF-α介導單磷酰脂A對大鼠小腸的預適應延遲保護作用*

楊彩紅1△， 張軒萍1， 梁月琴2， 李 焰2， 郝一彬1

(山西醫科大學1藥理教研室，2機能實驗室，山西 太原 030001)

目的探討降鈣素基因相關肽(CGRP)介導的單磷酰脂A(MLA)對大鼠小腸的預適應延遲保護作用是否通過抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)而產生。方法通過給予MLA(500 μg·kg-1，ip)藥物預適應，利用在體缺血再灌注(I/R)和原位灌流模型，檢測外周血、灌流液和組織中乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量和組織形態學改變以顯示缺血再灌注損傷和藥物的作用；通過放射免疫法測定血漿中CGRP和TNF-α含量探討MLA預適應對大鼠小腸保護作用的機制。結果與I/R組相比，給予MLA后可使I/R組LDH活性和MDA含量明顯降低(P<0.05)；同時MLA使I/R損傷大鼠CGRP含量顯著升高，TNF-α含量下降(P<0.01)。使用CGRP拮抗劑CGRP8-37及辣椒素(capsaicin)耗竭CGRP后，均可消除MLA的這一作用。結論MLA對在體、原位灌流大鼠小腸均誘導產生預適應的延遲保護作用；CGRP可能通過抑制TNF-α的產生而介導MLA誘導的預適應延遲保護作用。

單磷酰脂A； 降鈣素基因相關肽； 腫瘤壞死因子

預適應是對抗缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的一種最有效手段，有早期保護和延遲保護2個不同時相的作用。延遲預適應(delayed preconditioning)的保護作用需經過10多個小時才明顯形成，并能維持幾天甚至更長時間。預適應的保護作用不僅發生在心臟，也出現在心外組織[1]，本課題組早期的研究工作均表明小腸也存在預適應保護作用，而且表明其保護機制與KATP通道開放及內源性阿片肽的釋放有關[2-3]。

單磷酰脂A(monophosphoryl lipid A, MLA)是從細菌脂多糖中提取純化的一種內毒素的無毒衍生物。MLA預處理對動物在體心臟與離體心臟均能誘導產生延遲保護作用，顯著縮小心肌梗塞面積和改善心功能，其效果明確，毒副作用小，具有廣泛的臨床應用前景[4]。但其產生預適應保護作用的機制還不清楚，有研究結果表明，其預適應保護作用可能是通過刺激降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)的釋放誘導產生的[5-6]。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白細胞介素-6等細胞因子已確認參與介導缺血再灌注中的組織損傷。其中，TNF-α是缺血再灌注損傷中細胞因子連續反應中的一個關鍵性介質[7]。已有研究證明TNF-α在心臟、小腸缺血再灌注時均明顯升高，使用TNF-α單克隆抗體后能明顯減輕再灌注引起的器官損傷，改善組織器官功能，減輕機體的全身性損害，而CGRP含量升高則可明顯減輕再灌注損傷，CGRP抗體使用后可逆轉這一保護作用[8-9]。但TNF-α與CGRP在預適應中的地位和作用尚不十分清楚，本實驗采用MLA預適應給藥，利用大鼠小腸缺血再灌注模型，初步探討TNF-α與CGRP在MLA預適應中的作用及意義。

材 料 和 方 法

1試劑

MLA購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；CGRP和TNF-α放免試劑盒由解放軍總醫院科技開發放免所提供；其余試劑均為國產分析純。

2方法

2.1動物模型制備 健康Wistar雄性大鼠，體重(260±30) g，由山西醫科大學動物實驗中心提供。

2.1.1在體動物缺血再灌注模型制備 大鼠術前24 h禁食，自由飲水。以20%烏拉坦1 g·kg-1腹腔注射麻醉，舌靜脈注射肝素600 U·kg-1抗凝血。分離頸總動脈連接動脈血壓計，記錄動脈血壓以監測動物在實驗中的狀態。在動物腹部實行中線切口，分離腸系膜上動脈(superior mesenteric artery，SMA)。術后穩定20 min，用無創傷動脈夾夾閉SMA 30 min，再灌注60 min，制成缺血再灌注模型。

2.1.2原位灌流模型制備 參照文獻[10]方法在動物腹部實行中線切口，分離SMA及腸系膜上靜脈，由SMA主干插管，連蠕動泵持續恒流(6 mL·min-1)灌注。灌注液為37 ℃，經95% O2和5% CO2平衡的K-H改良液，腸系膜上靜脈插管導出液體。灌流開始后，腹主動脈放血處死動物。所有暴露的組織均置于塑料泡沫板上，并用鹽水浸泡的紗布敷蓋。用熱照法使整個灌流過程的溫度維持在(37.0±0.5) ℃，預灌注30 min后，開始實驗。

2.2實驗分組

2.2.1在體實驗動物分組 實驗動物隨機分為4組，每組8只：(1)對照組(control)：僅分離SMA，不夾閉，觀察90 min；(2)缺血再灌注組(I/R)：分離SMA，夾閉30 min，再灌注60 min，結束實驗；(3)MLA預適應組(MLA)：實驗前24 h給予MLA (500 μg·kg-1, ip)，其后操作同I/R組；(4)MLA溶劑組(MLA vehicle)：實驗前24 h給予同體積MLA溶劑(40%丙二醇、10%乙醇及50%生理鹽水，ip)，其后操作同I/R組。

2.2.2原位灌流實驗動物分組 實驗動物隨機分為6組，每組6～8只：(1)對照組(control)：持續灌流75 min，結束實驗；(2)缺血再灌注組(I/R)：停灌1 h后再灌注15 min，結束實驗；(3)MLA預適應組(MLA)：實驗前24 h給予MLA (500 μg·kg-1，ip)，余同I/R組；(4)MLA溶劑組(MLA vehicle)：實驗前24 h給予同體積MLA溶劑，余同I/R組；(5)辣椒素(capsaicin)+MLA組：戊巴比妥鈉麻醉后，連續4 d注射capsaicin(50 mg·kg-1·d-1, sc)耗竭CGRP，余同MLA組；(6)CGRP8-37+MLA組：實驗前24 h給予MLA (500 μg·kg-1, ip)，實驗時用濃度為10-7mol·L-1的CGRP8-37灌流5 min，隨后操作同I/R組。

2.3標本采集及處理

2.3.1血清LDH活性的測定 實驗結束時，腹主動脈取血4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒方法測定。

2.3.2血漿CGRP測定 同上取血3 mL，加入備有10%乙二胺四乙酸鈉30 μL和400 U·L-1抑肽酶的試管中，4 000 r/min離心20 min(4 ℃)，取上清，-20 ℃保存備用。按試劑盒方法測定。

2.3.3血漿TNF-α的測定 同上取血，加入備有10%乙二胺四乙酸鈉的試管中，3 000 r/min離心10 min(4 ℃)，取上清，-20 ℃保存備用。按試劑盒方法測定。

2.3.4在體組織形態學分析 取回盲部以上10 cm的小腸組織，迅速置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察形態學改變。按文獻分級方法[10]觀察小腸黏膜出血的病理損傷：0°：無出血；Ⅰ°：散在點狀出血；Ⅱ°：大段出血占1/4腸段(從十二指腸到回腸)；Ⅲ°：50%以上腸段出血；Ⅳ°：幾乎全部小腸段出血。

2.3.5小腸組織MDA含量測定 取回盲部以上10 cm處小腸組織，加其9倍體積生理鹽水，用電動勻漿器制成10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，按試劑盒方法測定。

2.3.6灌流液LDH活性、TNF-α和CGRP含量測定 收集再灌后5 min的灌流液，分別4 ℃和-20 ℃密封保存，按試劑盒方法測定。

2.3.7原位灌流組織形態學分析 同上取小腸組織，迅速置于中性甲醛液中固定，石蠟包埋，HE染色光鏡下觀察形態學改變。參照文獻分級方法[10]，根據小腸組織損傷的程度，將其分為0～Ⅷ級：0級為正常的小腸黏膜；Ⅰ級病理損傷為絨毛端上皮下空間的增大；Ⅱ級為這種空間的進一步擴大；Ⅲ級則有大量的上皮在絨毛邊緣起伏；Ⅳ級有絨毛上皮的剝落；Ⅴ級有絨毛自身的脫落；Ⅵ級發展到小腸隱窩層的損傷；Ⅶ級為整個小腸黏膜的壞死；Ⅷ級則有穿透性的梗死。

3統計學處理

結 果

1在體實驗結果

結果顯示，I/R可使小腸黏膜明顯損傷，LDH和MDA水平顯著升高，與對照組比較差異顯著(P<0.01)；MLA則可明顯改善小腸黏膜的I/R損傷，同時使LDH和MDA水平顯著降低(P<0.05)，見圖1及表1、2。

Figure 1. Representative example of small intestine mucosal hemorrhage frominvivoexperiment(HE staining,×200).A：control;B:I/R;C:MLA;D:MLA vehicle.

圖1MLA預處理對在體大鼠小腸病理改變的作用

表1單磷酰脂A預處理對缺血再灌注損傷大鼠小腸病理改變的保護作用

GroupHemorrhagicdegreeofmucosa0ⅠⅡⅢⅣMeangradeControl620000.25I/R002333.13**MLA043101.63#MLAvehicle001243.43**

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsI/R.

I/R使大鼠血漿中TNF-α水平顯著升高，與對照組比較差異顯著(P<0.01)；MLA預適應則使血漿中TNF-α含量降低，與I/R組相比有顯著差異(P<0.01)。血漿CGRP結果顯示，I/R使血漿CGRP水平顯著降低，MLA預適應則使I/R損傷大鼠血漿CGRP顯著回升，與I/R組相比差異顯著(P<0.01),見表2。

2原位灌流實驗結果

2.1灌注液中LDH活性和組織中MDA含量的變化 I/R使灌流液中LDH和組織中MDA與對照組相比顯著增加(P<0.01)；而MLA預適應可顯著降低I/R引起的LDH、MDA增加，使灌流液中LDH和組織中MDA下降(P<0.01)。但給予CGRP8-37及capsaicin后，則逆轉MLA的上述作用，使LDH和MDA水平又重新回升，與I/R組比較無顯著差異(P>0.05),見表3。

表2單磷酰脂A預處理對缺血再灌注大鼠血清LDH活性、血漿CGRP和TNF-α含量及小腸MDA含量的影響

GroupnLDH(U·L-1)MDA(μmol·g-1protein)TNF-α(μg·L-1)CGRP(ng·L-1)Control8300.80±20.521.04±0.270.94±0.1656.60±5.44I/R81014.82±141.19**2.69±0.52**1.54±0.44**43.55±2.70*MLA8472.17±36.71##1.34±0.45##1.01±0.20##85.49±11.26**##MLAvehi-cle7862.35±30.61**3.15±0.86**1.47±0.37**40.29±6.30**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsI/R.

表3單磷酰脂A預處理對原位灌流大鼠小腸灌流液中LDH活性、CGRP和TNF-α含量及小腸組織中MDA含量的影響

GroupnLDH(U·L-1)MDA(μmol·g-1protein)TNF-α(μg·L-1)CGRP(ng·L-1)Control8435.86±91.181.60±0.870.36±0.12135.32±45.37I/R8871.71±187.12**4.28±1.35**1.12±0.12**73.68±27.50MLA8512.59±136.15##2.22±1.19#0.54±0.14#341.20±103.22*##CGRP8-37+MLA8729.41±283.84**4.20±2.58**1.17±0.20**175.73±44.51Capsaicin+MLA7866.11±214.99**4.15±1.20**1.12±0.21**44.67±10.14MLAvehicle8831.40±173.49**4.83±2.52**1.16±0.23**111.13±28.85

*P<0.05,**P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsI/R.

2.2小腸組織形態變化 I/R可以引起小腸黏膜的嚴重損傷，平均分級由對照組的0.25升至7.00(P<0.01)；MLA可顯著降低損傷程度，與I/R組比較差異顯著(P<0.05)；給予CGRP8-37及capsaicin則可逆轉MLA對大鼠小腸的保護作用，使損傷程度加重，與對照組比較差異顯著(P<0.05)，見圖2、表4。

2.3灌流液中的CGRP和TNF-α含量的改變 MLA可顯著刺激CGRP的釋放，與I/R組比較有顯著差異(P<0.01)。I/R使灌流液中TNF-α水平顯著升高(P<0.01vs對照組)，而MLA可使I/R損傷后灌流液中TNF-α降低，與I/R組相比差異顯著(P<0.05)。但給予CGRP8-37及capsaicin后，則逆轉MLA這一作用，灌流液中TNF-α水平又重新升高至I/R組水平，與對照組相比差異顯著(P<0.01),見表3。

討 論

近年發現CGRP對缺血心肌具有保護作用，但其機制目前還不清楚。在離體大鼠心臟和心臟外器官的缺血預適應發現，CGRP是一種內源性保護物質，可能是預適應保護作用中的共同介質[11-12]， 研究表明，MLA介導的心臟預適應延遲保護作用與CGRP的大量產生有關，而capsaicin可消除MLA的預適應保護作用[13]，說明CGRP參與介導MLA的心肌預適應延遲保護作用。本實驗結果證實，實驗前24 h給予大鼠MLA(500 μg·kg-1, ip)后，與I/R組比較，發現MLA可以明顯地降低LDH、MDA的釋放，顯著抑制I/R引起的小腸黏膜損傷，減輕小腸水腫。給予10-7mol·L-1CGRP受體阻斷劑CGRP8-37，及CGRP耗竭劑capsaicin(50 mg·kg-1, sc)后，則可顯著扭轉MLA的保護作用。證明MLA可誘導大鼠小腸產生預適應延遲保護作用，CGRP參與并介導了這一過程。

TNF是一種具有廣泛生物活性的多功能細胞因子，主要由被激活的巨噬細胞或單核細胞產生，具有防御和致損傷的雙重作用。在體內適量產生TNF，對機體具有重要的免疫調節和保護作用；隨著TNF在體內濃度的持續增加，則參與機體的多種病理改變，甚至造成多器官損傷[14]。缺血再灌注導致TNF-α含量的大量增加，且對抗缺血再灌損傷的缺血預適應與抑制或阻斷TNF-α產生有關[8]，提示TNF-α可能是缺血預適應信號轉導通路中的一個刺激因子。研究表明缺血預適應和CGRP預適應均可抑制TNF-α的產生，而CGRP8-37和capsaicin可以消除缺血預適應或CGRP預適應對TNF-α的抑制作用[8]，表明CGRP介導的預適應保護作用可能同抑制TNF-α的產生有關。本實驗結果同樣證實，MLA預適應可以抑制伴隨缺血再灌損傷產生的TNF-α的增加；CGRP8-37或capsaicin可消除MLA預適應對TNF-α的抑制作用。有研究證明TNF-α在缺血再灌注損傷中還可誘導激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，使NO合成增加[15]，而NO已經被證明為心肌早期缺血預適應保護作用的誘發物質之一。MLA可通過增加NO的釋放和合成刺激CGRP的釋放從而產生預適應的延遲保護作用，而給予CGRP8-37或用capsaicin耗竭CGRP后，其保護作用消失[5]。CGRP促進內皮細胞分泌NO的作用與其增加內皮細胞內游離Ca2+水平可能有密切關系。NOS為鈣依賴性激酶，CGRP升高細胞內游離Ca2+，在鈣調素的輔助作用下激活細胞內NOS，促使大量L-精氨酸轉變為NO，從而發揮生物學效應[16]。由此，我們或可推測MLA對大鼠小腸預適應保護作用的產生原因可能是：(1)MLA誘導CGRP生成增加，同時TNF-α作為缺血再灌注損傷的誘導因子，使NO合成增加，進而刺激CGRP的產生，并伴同CGRP介導預適應保護作用；(2)CGRP產生后一方面抑制TNF-α的繼續增加，阻止其對機體組織器官的致損傷作用，另一方面進一步促進CGRP的增加，而產生對大鼠小腸的預適應保護作用。有關CGRP通過抑制TNF-α產生預適應保護作用的機理目前還不清楚，上述假設還需進一步驗證才可證實。

Figure 2. Repersentative examples of small intestine mucosal injury frominvitroexperiment(HE staining,×100).A:control;B:I/R;C:MLA;D:MLA vehicle;E:capsaicin+MLA;F:CGRP8-37+MLA.

圖2MLA預處理對大鼠原位灌流小腸病理改變的作用

表4 單磷酰脂A預處理對原位灌流大鼠小腸病理改變的保護作用

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsI/R.

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Calcitoningene-relatedpeptidemediatesdelayedpreconditioningofmonophosphoryllipidAbydecreasingtumornecrosisfactorαinratsmallintestine

YANG Cai-hong1, ZHANG Xuan-ping1, LIANG Yue-qin2, LI Yan2, HAO Yi-bin1

(1DepartmentofPharmacology,2FunctionalLaboratory,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:tyyangxiaoluo@163.com)

AIM: To explore whether monophosphoryl lipid A participates in the protective process of the delayed ischemic preconditioning in the small intestine of rats, and whether endogenous calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor α are mediators in this process.METHODSIntestinal ischemia was induced by occlusion of super mesenteric artery for 30 min, followed by reperfusion for 60 min. The ischemia/reperfusion(I/R) injury was made by 1 h ischemia and 15 min reperfusioninsituperfusion in rat small intestine. The intestine lesions were evaluated by the measurement of serum lactate dehydrogenase and malondialdehyde in the small intestinal tissues. In addition, calcitonin gene-related peptide and tumor necrosis factor α in plasma and superior mesenteric vein effluent were also examined.RESULTSPretreatment with monophosphoryl lipid A (500 μg/kg, ip) 24 h prior to I/R significantly alleviated the histolo-gical lesions of intestinal tissues, decreased serum level of lactate dehydrogenase and reduced the tissue content of malondialdehyde. Moreover, monophosphoryl lipid A markedly increased plasma concentrations of calcitonin gene-related peptide and decreased plasma concentrations of tumor necrosis factor α. Pretreatment with capasicin, which specifically depletes the neurotransmitter content of sensory nerves, or calcitonin gene-related peptide (8-37), a selective calcitonin gene-related peptide receptor antagonist, inhibited the increase in calcitonin gene-related peptide release and subsequently abrogated the protective effect of monophosphoryl lipid A.CONCLUSIONMonophosphoryl lipid A pharmacologically mimics delayed preconditioning, which may be related to the stimulation of calcitonin gene-related peptide release and inhibition of tumor necrosis factor α production in rat small intestine.

Monophosphoryl lipid A; Calcitonin gene-related peptide; Tumor necrosis factor

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.016