Aβ1-42作用的小膠質細胞對體外培養的神經干細胞生存的影響*

韋美丹, 林繼宗, 朱 寧, 王克萬, 王 勇△

(1南方醫科大學珠江醫院藥劑科, 廣東 廣州 510282； 2中山大學第三附屬醫院肝膽外科, 廣東 廣州 510630； 3南方醫科大學南方醫院神經外科, 廣東 廣州 510015)

1000-4718(2012)04-0683-06

2011-12-27

2012-03-09

國家自然科學基金資助項目 (No.30973162); 廣東省自然科學基金資助項目 (No.07005203)

△通訊作者 Tel:020-61643555; E-mail:yongwh2005@163.com

Aβ1-42作用的小膠質細胞對體外培養的神經干細胞生存的影響*

韋美丹1, 林繼宗2, 朱 寧1, 王克萬3, 王 勇1△

(1南方醫科大學珠江醫院藥劑科, 廣東 廣州 510282；2中山大學第三附屬醫院肝膽外科, 廣東 廣州 510630；3南方醫科大學南方醫院神經外科, 廣東 廣州 510015)

目的探討β-淀粉樣蛋白(Aβ1-42)作用的小膠質細胞對體外培養的神經干細胞(NSCs)生存的影響。方法利用Transwell小室在體外建立NSCs與小膠質細胞共培養體系，檢測Aβ1-42蛋白作用小膠質細胞前后NSCs增殖、分化及凋亡情況。結果與單純共培養組相比，Aβ1-42干預共培養組的增殖率降低，且微管相關蛋白2(MAP-2)和膽堿乙酰轉化酶(CHAT)陽性表達率也均降低。結論Aβ1-42介導的炎癥反應抑制了神經干細胞的增殖，促進其凋亡，并能顯著降低其分化成神經元尤其是膽堿能神經元的能力。

小膠質細胞；神經干細胞；阿爾茨海默病； 淀粉樣β蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種神經元進行性丟失和認知障礙的中樞神經系統退行性疾病[1]。β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid protein, Aβ)沉積激活小膠質細胞引起的炎癥反應是導致AD腦內神經元丟失的重要原因[2]。神經干細胞(neural stem cells, NSCs)是一種具有自我更新和多向分化潛能的神經前體細胞，正常條件下可以分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等。但是，從神經干細胞技術治療AD構想的提出到現在，無論是促進AD患者內源性神經細胞生成還是外源性神經干細胞移植，均未獲得成功。這可能與Aβ致AD患者顱內“微環境”改變有關。因此，如何改善AD腦內“微環境”進行干細胞移植成為治療AD研究熱點。本研究旨在利用Transwell裝置建立神經干細胞和小膠質細胞共培養體系，在細胞水平上探討Aβ作用的小膠質細胞對神經干細胞生存的影響，以證實Aβ介導的神經細胞生成抑制是否通過小膠質細胞間接實現。

材 料 和 方 法

1材料

新生SD大鼠由南方醫科大學實驗動物中心提供[合格證號為SCXK (粵) 2006-0015]。DMEM/F12、B27、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰酶和L-谷氨酰胺(L-glutamine,L-Gln)均購自Gibco；表皮生長因子(epidermal growth factor, EFG)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth, bFGF)均購自R&D system；神經巢蛋白(nestin)、5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2'-deoxyuridine, BrdU)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、CD11b/c、微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)、膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase, CHAT)抗體及相關Ⅱ抗均購自Abcam; 多聚賴氨酸、Aβ1-42、Hoechst 33258及annexin V-FITC/PI檢測試劑盒購自Sigma；Transwell板 (孔直徑0.4 μm) 購自Costar。

2方法

2.1大鼠神經干細胞分離、培養與鑒定 參照蘭艷纖等[3]的方法,新生SD大鼠海馬組織中分離出的細胞用含EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)、B27(2%)、L-Gln(2%)和青鏈雙霉素(1%)的DMEM/F12培養液重懸后以1×109/L接種于25 cm2透氣培養瓶內。置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，每3～4 d半量換液第7 d結束原代培養并進行傳代培養，每6～7 d傳代1次。取第2代NSCs進行nestin鑒定；第2代神經細胞球制備單細胞懸液，加入10 μmol/L BrdU標記24 h后全量換液培養4 d后將神經細胞球轉移到用多聚賴氨酸包處理的24孔板中貼壁培養2 h后，免疫熒光鑒定細胞增殖能力；第2代神經干細胞用含10% FBS的DMEM/F12培養液進行正常分化處理，分化10 d后分別行GFAP和MAP-2免疫細胞熒光染色鑒定細胞多向分化潛能。

2.2大鼠小膠質細胞的純化、培養與鑒定 參照雷露雯等[4]的方法，新生SD大鼠海馬組織經0.125% 胰蛋白酶消化后離心，棄上清，細胞沉淀用含10% FBS的DMEM/F12培養基重懸，單細胞懸液以5×108/L細胞密度接種于經多聚賴氨酸包被處理的75 cm2透氣培養瓶中，37 ℃、5% CO2孵育箱中培養2 d后全量換液，待培養至7～9 d，手搖法分離純化小膠質細胞，并通過小膠質細胞特異性抗體CD11b/c進行免疫細胞化學檢測，同時以Hoechst 33258對細胞核進行復染，以明確細胞總數，計算小膠質細胞純度。

2.3共培養體系的建立與實驗分組 用6孔板的Transwell小室構建雙層細胞共用培養液而不直接接觸的共培養體系。將Transwell小室作為培養體系上室，接種NSCs，培養體系下室為6孔塑料培養板，接種純化后的小膠質細胞，探討Aβ1-42激活小膠質細胞前后對NSCs生存的影響。實驗分4組：(1) 空白對照組(control)：神經干細胞正常培養于上室，下室加培養基；(2) 實驗對照組(Aβ1-42+NSCs)：神經干細胞培養于上室，下室加入10 μmol/L Aβ1-42的培養基；(3) 單純共培養組(microglia and NSCs coculture)：神經干細胞與小膠質細胞以1∶1的濃度比依次接種于上室和下室； (4) Aβ1-42干預共培養組(Aβ1-42+microglia and NSCs coculture)：神經干細胞與小膠質細胞以1∶1的濃度比依次接種于上室和下室，同時小膠質細胞層加入10 μmol/L Aβ1-42。各處理組于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養96 h后，進行后續指標檢測。

2.4BrdU摻入法檢測神經干細胞增殖率 第2代神經干細胞球制備成單細胞懸液，加入10 μmol/L BrdU標記24 h后，收集細胞并重懸。細胞懸液按照實驗分組情況分別進行加藥處理。共培養96 h后將各組神經細胞球轉移到用多聚賴氨酸包被處理過的24孔板中貼壁培養2 h后，按常規方法進行免疫熒光鑒定各組細胞BrdU表達，即：收集各組細胞，4% 多聚甲醛室溫固定；0.3% Triton X-100透化處理；10% 山羊血清封閉后，小鼠抗BrdU單抗4 ℃濕盒孵育過夜；FITC羊抗小鼠IgG避光孵育1.5 h。Hoechst 33258核染后，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.5流式細胞儀檢測神經干細胞分化 第2代神經干細胞球用含10% FBS的DMEM/F12培養液進行正常分化處理5 d后，按照實驗分組情況分別進行加藥處理。共培養96 h后行MAP-2和CHAT免疫熒光染色。所用Ⅰ抗分別為鑒定神經元的小鼠抗MAP-2單抗和鑒定膽堿能神經元的兔抗CHAT多克隆抗體。所用Ⅱ抗分別為FITC標記的抗小鼠IgG和抗兔IgG 抗體。采用流式細胞儀(FACS)分析，用Cell Quest 3.0 軟件進行分析。

2.6流式細胞儀分析神經干細胞凋亡率 第2代神經干細胞球制備成單個細胞懸液并用含EGF(20 μg/L)、bFGF(20 μg/L)、B27(2%)、L-Gln(2%)和青鏈雙霉素(1%)的DMEM/F12培養液重懸，然后按照實驗分組情況分別進行加藥處理。各組細胞經處理96 h之后，參照annexin V-FITC/PI檢測試劑盒說明書進行前期處理后，上流式細胞儀檢測。

3統計學處理

結 果

1NSCs培養及鑒定

倒置顯微鏡鏡下觀察：原代接種的細胞為圓型、透亮的單個細胞，培養2～4 d后，可形成由數十至數百個細胞組成的神經干細胞球，細胞球球體透亮，形態規則，邊緣整齊，邊界清晰，排列緊密，周邊有亮的光暈，培養液中懸浮生長，見圖1A；經免疫熒光鑒定神經細胞球表達nestin陽性，見圖1B；BrdU陽性，見圖2。10% FBS分化條件下培養，細胞呈貼壁生長，可見細胞逐漸從球體中“爬”出來，培養5 d后細胞呈多種形態，見圖3A；經免疫熒光鑒定部分細胞呈MAP-2陽性，見圖3B；GFAP陽性，見圖3C。

Figure 1. Morphology and identification of the cultured fetal neural stem cells derived from the hippocampus (scale bar=100 μm). A:inverted microscope photograph showed numerous neurospheres at 3 d of primary culture. B: most of the cells in the second passage of neurospheres were nestin positive.

圖1神經干細胞的培養與鑒定

Figure 2. Identification of the neural stem cells (NSCs) by BrdU incorporation. Nearly all cells expressed high level of BrdU (A and C, green). Nuclei were counterstained with Hoechst 33258 (B and C, blue). Scale bar=100 μm.

圖2BrdU摻入法檢測NSCs增殖

Figure 3. Identification of the neural stem cells (NSCs) by immunofluorescence.A:a number of cells migrated from the neurosphere and were induced by 10% FBS for 5 dinvitro(×400);B:the microtubule-associated protein 2 (MAP-2) positive cells differentiated from passage neurospheres (green);C:the glial fibrillary acidic protein (GFAP) positive cells differentiated from passage neurosphere (red). Scale bar=100 μm in B and C.

圖3免疫熒光檢測NSCs分化

2小膠質細胞培養與鑒定

原代培養的細胞主要是以星形膠質細胞為主，并含有小膠質細胞、神經元和少量的少突膠質細胞，見圖4A。細胞培養9 d出現分層現象后，通過手搖法分離純化獲得小膠質細胞。顯微鏡下觀察：小膠質細胞胞體扁平或卵圓形,突起細長，見圖4B。經CD11b/c免疫熒光檢測，陽性率在95%以上，見圖5。

Figure 4. Isolation and purification of microglia (×200).A: morphology of the primary glial cells 9 d after culture;B: the purity of microglia 2 d after culture.

圖4小膠質細胞分離純化

Figure 5. Identification of the purified microglia by CD11b/c immunofluorescent staining(scale bar=100 μm). A:the localization of CD11b/c was shown in red;B:nuclei were counterstained with Hoechst 33258;C:a merged image showed that more than 95% cells were double positive for microglial marker CD11b/c.

圖5免疫熒光鑒定小膠質細胞

3BrdU摻入法檢測神經干細胞增殖

BrdU摻入法檢測各組神經干細胞增殖率依次為：78.78%±5.49%、48.58%±1.83%、77.23%±14.77%和26.95%±3.30%。數據顯示，單純共培養組與空白對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)，而Aβ1-42干預共培養組與實驗對照組及單純共培養組相比差異均有統計學意義(均P<0.01)。這表明未經Aβ1-42作用的小膠質細胞對NSCs增殖影響不顯著；Aβ1-42既能直接影響NSCs的增殖，又能通過作用于小膠質細胞使NSCs增殖抑制加強，見圖6。

Figure 6. The proliferation of NSCs detected by BrdU incorporation (scale bar=100 μm). A:NSCs control;B: Aβ1-42+NSCs;C:microglia and NSCs coculture;D:Aβ1-42+microglia and NSCs coculture. The proportion of BrdU positive cells (A-D, green) relative to total cell count was estimated under a fluorescent microscope.Nuclei were counterstained with Hoechst 33258 (A-D, blue).

圖6BrdU摻入法檢測NSCs增殖

4小膠質細胞對共培養NSCs分化的影響

圖7顯示，單純共培養組的MAP-2和CHAT陽性細胞數少于空白對照組(P<0.01)。與實驗對照組和單純共培養組相比，共培養體系中10 μmol/L Aβ1-42作用于小膠質細胞后， MAP-2和CHAT陽性細胞數減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。

5流式細胞儀檢測NSCs凋亡率

表1顯示，單純共培養NSCs與小膠質細胞時，NSCs凋亡率與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。而在共培養體系中，小膠質細胞層中加入10 μmol/L Aβ1-42共同孵育96 h后，NSCs凋亡率均高于實驗對照組與單純共培養組，差異均有統計學意義(P<0.01)。

討 論

Transwell是一種帶有Transwell小室、外形為一個可放置在細胞培養板里的小杯子，杯子底層具有通透性的聚碳酸酯膜的裝置，目前主要應用于細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲、共培養等多種方面的研究。近年來，越來越多的學者利用共培養技術研究細胞與細胞或是細胞與組織間的相互作用[5]。而這些研究主要是采取同一培養瓶、細胞相互接觸的方法進行共培養，針對的對象主要為神經元，關于NSCs共培養研究較少。我們根據孔徑0.4 μm的Transwell半透膜僅可以通過培養液而不能透過細胞的特點，在6孔塑料培養板上架起Transwell小室，構建NSCs與小膠質細胞共培養體系。與以往研究不同的是，我們采用Transwell這種特殊裝置，實現非接觸性細胞通訊，觀察共培養體系中小膠質細胞在Aβ1-42作用下對NSCs生存的影響。為此，獲得高純度的神經干細胞和小膠質細胞是本研究構建共培養體系成功與否的關鍵。

Nestin(巢蛋白)是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性表達在神經上皮干細胞上的一種分子標記物，是目前鑒定神經干細胞的主要特征性標記物[6]。本研究從新生SD乳鼠的海馬組織中分離出單細胞重懸于無血清的DMEM/F12培養基中培養第3 d即可見神經細胞球，懸浮于培養液中。神經球經0.125 %胰酶消化成單個細胞懸液進行傳代培養，3～4 d后重新形成神經球，數量明顯多于第1代，免疫熒光鑒定呈nestin陽性，證實具有神經干細胞特性。神經干細胞除能表達nestin外，在功能上具有增殖分化的能力，因此，我們繼續觀察了培養的細胞球增殖分化的能力。將原細胞球分散成單細胞后，用10 μmol/L BrdU標記24 h后全量換液培養4 d后，行免疫熒光鑒定。結果顯示絕大多數細胞呈BrdU陽性，說明它們是具有分裂、增殖能力的細胞。當神經球重懸于含10% FBS的DMEM/F12并接種于預先經多聚賴氨酸包被的24孔板時，神經球開始貼壁分化，可見細胞從球體周圍逐漸遷移，隨著時間的推移出現突起細胞并漸有突起增長、相互連接交織成網，形成可表達MAP-2、GFAP的神經元樣細胞和膠質細胞樣細胞，提示培養的神經干細胞具有分化為神經元及神經膠質細胞的潛能，從而也進一步證實了神經干細胞的多向分化潛能。

圖7各組MAP-2及CHAT陽性細胞熒光表達率的比較

表1各組神經干細胞凋亡率的比較

GroupApoptoticrateNSCscontrol5.76±2.01Aβ1-42+NSCs25.77±0.48**MicrogliaandNSCscoculture8.43±5.35##Aβ1-42+microgliaandNSCscoculture45.19±1.02**##

**P<0.01vsNSCs control;##P<0.01vsAβ1-42+NSCs.

關于小膠質細胞的培養，目前學者們主要是采用搖床振搖和利多卡因分離的方式從混合培養的神經膠質細胞中分離小膠質細胞[4, 7]。本研究考慮到分離的小膠質細胞純度會直接影響到Transwell體系的建立，我們采用了溫和的手搖法從混合培養的神膠質細胞中分離小膠質細胞。該方法收集到的小膠質細胞生長狀態較佳，細胞胞體呈圓型并具有較好的折光性，30 min內即可貼壁。同時，收獲的小膠質細胞貼壁培養30 min后全量換液，去除未貼壁的細胞可達到純化的目的。繼續培養2 d后，可出現較多較短突起，少數細長突起，部分為圓型或橢圓形。經免疫熒光鑒定，分離的細胞有95% 可表達CD11b/c陽性，即為小膠質細胞。本研究體外獲得了高純度、高活力的神經干細胞和小膠質細胞，為Transwell共培養體系的建立提供了良好的細胞來源。

體內外研究均提示Aβ可激活小膠質細胞[8]，激活的小膠質細胞后可釋放多種細胞因子、趨化因子、補體及其激活物，導致非特異性炎細胞浸潤，產生慢性炎性反應[9]。這種效應能否破壞腦內神經細胞生存和分化環境，造成內源性或移植的外源性神經干細胞不能發揮正常功能，導致AD腦內丟失的神經細胞得不到及時補充，目前尚未得到證實。因此，本實驗建立神經干細胞和小膠質細胞共培養體系，先觀察了Aβ1-42作用于小膠質細胞前后神經干細胞的增殖、分化情況。結果顯示未經Aβ1-42作用的小膠質細胞對共培養的神經干細胞的增殖無明顯影響作用，以往的研究也有類似報道[10]；但神經干細胞分化成神經元和膽堿能神經元的比例下降，這可能與正常情況下小膠質細胞分泌某些因子有關。研究表明Aβ1-42能夠直接抑制神經干細胞的增殖，促進其凋亡，減少其分化成神經元、膽堿能神經元的比例。在神經干細胞與小膠質細胞共培養體系中，Aβ1-42抑制神經干細胞自我更新能力及多向分化潛能的這種作用尤為明顯，證實了Aβ1-42對神經細胞生存抑制的作用可能通過小膠質細胞而加強。也許正是這些因素，導致AD腦內微環境改變，影響內源性或外源性NSCs的生存。這既構成目前臨床上應用NSCs治療AD的嚴峻的挑戰，也為AD的進一步治療提供了新的線索。

因此，通過干預小膠質細胞改善患者腦內“微環境”，促進內源性或外源性NSCs生存，是干細胞移植治療神經元退行性疾病的有效途徑。而Aβ介導的炎癥反應與NSCs失能之間的關系及作用機制還須進一步深入研究。

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EffectsofAβ1-42-inducedmicroglialcellsonsurvivalofneuralstemcellsinvitro

WEI Mei-dan1, LIN Ji-zong2, ZHU Ning1, WANG Ke-wan3, WANG Yong1

(1DepartmentofPharmacy,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510282,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;3DepartmentofNeurosurgery,SouthernHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:yongwh2005@163.com)

AIM: To explore the effects of β-amyloid protein 1-42 (Aβ1-42)-induced microglia on the survival of cultured neural stem cells (NSCs)invitro.METHODSUsing the Transwell chambers to build a coculture system of NSCs and microglia, we detected the proliferation, differentiation and apoptosis of the NSCs with the microglia before and after induction by Aβ1-42.RESULTSCompared with non-intervention group, the proliferation rate of NSCs in Aβ1-42intervention coculture group decreased, as well as the positive expression rates of microtubule-associated protein 2 (MAP-2) and choline acetyltransferase.CONCLUSIONThe inflammation mediated by Aβ1-42inhib their the proliferation of NSCs and induces their apoptosis. Inflammation also significantly reduces the ratio of NSCs differentiating to neurons, especially to cholinergic neurons.

Microglial; Neural stem cells; Alzheimer disease; Amyloid beta-protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.018