人羊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)重建角膜上皮的實(shí)驗(yàn)研究*

劉小勇， 陳 劍△， 周 清， 吳 靜， 王彥平， 金 玲， 徐錦堂， 賀春香， 姚 敏

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院眼科， 2醫(yī)學(xué)院眼科研究室， 3醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 廣東 廣州 510630；4深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院眼科， 廣東 深圳 518101)

1000-4718(2012)04-0689-05

2011-11-01

2012-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30872808；No. 81100637)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(No. A2009364)

△通訊作者 Tel: 020-38688116； E-mail: drchenj@163.com

人羊膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)重建角膜上皮的實(shí)驗(yàn)研究*

劉小勇1， 陳 劍1△， 周 清1， 吳 靜2， 王彥平3， 金 玲4， 徐錦堂2， 賀春香1， 姚 敏1

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院眼科，2醫(yī)學(xué)院眼科研究室，3醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 廣東 廣州 510630；4深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院眼科， 廣東 深圳 518101)

目的探討人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)誘導(dǎo)分化為角膜上皮細(xì)胞的可塑性及其重建角膜上皮的可行性。方法取足月產(chǎn)人羊膜，通過(guò)膠原酶、胰蛋白酶和EDTA消化獲得HAECs，將細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增、傳代，將2～3代HAECs接種于去上皮的兔角膜基質(zhì)上培養(yǎng)，待HAECs融合形成單層后，置于插入式培養(yǎng)皿中進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)14 d。對(duì)角膜基質(zhì)上培養(yǎng)的HAECs用光鏡、掃描電鏡和透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)觀察，以及細(xì)胞角蛋白(CK)3/12的免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果HAECs可在角膜基質(zhì)上生長(zhǎng)，培養(yǎng)1～2 d可形成單層，氣液界面培養(yǎng)14 d可形成4～5層細(xì)胞的復(fù)層上皮，掃描電鏡觀察細(xì)胞表面有豐富的微絨毛，透射電鏡下可見(jiàn)上皮細(xì)胞之間有橋粒連接，免疫組化檢測(cè)復(fù)層細(xì)胞表達(dá)CK3/12，所形成的復(fù)層結(jié)構(gòu)與正常角膜上皮相似。結(jié)論HAECs有可能作為種子細(xì)胞用于組織工程角膜上皮重建。

羊膜； 角膜； 上皮細(xì)胞； 組織工程

嚴(yán)重的眼表熱灼傷和化學(xué)傷、Stevens-Johnson 綜合征和眼類天皰瘡等所致的眼表?yè)p傷，可引起角膜緣干細(xì)胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)，表現(xiàn)為角膜上皮結(jié)膜化、角膜新生血管、角膜基質(zhì)瘢痕，最終導(dǎo)致視力嚴(yán)重受損。傳統(tǒng)的眼表重建術(shù)普遍存在供體來(lái)源匱乏、免疫排斥等缺點(diǎn)，組織工程角膜上皮重建給這類患者的治療帶來(lái)了希望，用培養(yǎng)的自體角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行角膜上皮重建已經(jīng)取得成功[1]，但由于其來(lái)源有限且對(duì)健眼不可避免地造成損傷，在臨床上應(yīng)用受到一定限制；對(duì)于雙眼角膜緣干細(xì)胞缺乏者，則根本無(wú)自體角膜緣干細(xì)胞可供培養(yǎng)。

羊膜是位于羊膜腔內(nèi)的一層薄膜，人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)具有干細(xì)胞的某些的特性[2]。像許多未成熟細(xì)胞或干細(xì)胞一樣，HAECs表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ類抗原很少[1,3]。HAECs和角膜上皮細(xì)胞都是由外胚層分化而來(lái)，HAECs和角膜緣干細(xì)胞有相似的生物學(xué)特性。本實(shí)驗(yàn)探討HAECs體外重建角膜上皮的可能性。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 新西蘭白兔(體重2.5～3.0 kg)由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2人羊膜的取材 人羊膜組織取自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院剖宮產(chǎn)分娩健康產(chǎn)婦的胎膜，人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、甲肝、乙肝、梅毒等血清學(xué)檢測(cè)均為陰性。取材前征得產(chǎn)婦知情同意及醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將羊膜與絨毛膜鈍性分離，置于含有1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的PBS中反復(fù)沖洗。

1.3主要試劑 培養(yǎng)基DMEM (Gibco)，10%優(yōu)級(jí)胎牛血清 (Gibco)，10 μg/L 表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF, Peprotech)，4 mmol/ L谷氨酰氨(Sigma)，青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L和膠原酶Ⅱ(Gibco)，胰蛋白酶(Amresco)，EDTA(Amresco)。小鼠抗人細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)3/12單克隆抗體(Chemicon)，插入式培養(yǎng)皿Millipore-CM，孔徑0.4 μm，直徑30 mm。

2方法

2.1HAECs的培養(yǎng)及觀察 將漂冼后的羊膜用眼科剪剪成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，加入0.2%的膠原酶在37 ℃孵箱靜置消化2 h，1 000 r/min離心5 min，吸出膠原酶消化液，再加入1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化液在室溫下消化10 min，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，以1×108cells/L HAECs 2 mL細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液1 次，一般5～7 d以1∶3 傳代1次。培養(yǎng)的HAECs每天在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及其生長(zhǎng)、增殖狀況。

2.2表層角膜基質(zhì)的制備 無(wú)菌條件下摘取新西蘭白兔眼球，徹底剪除球結(jié)膜及筋膜囊，正庚醇棉片敷在角膜上，30s后用棉簽擦去整個(gè)角膜的表層細(xì)胞，特別是角膜緣區(qū)上皮細(xì)胞，在解剖顯微鏡下觀察，確保角膜上皮細(xì)胞完全被去掉，無(wú)殘留。板層分離角膜，鉆取直徑7.5mm基質(zhì)片，黏附在無(wú)菌96 孔培養(yǎng)板底，加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，備用。隨機(jī)選取3 片用以上方法制備的角膜基質(zhì)片進(jìn)行掃描電鏡檢查，確保無(wú)上皮殘留才使用。

2.3HAECs在角膜基質(zhì)上的生長(zhǎng)分化及體外角膜上皮的重建 (1)實(shí)驗(yàn)組：將獲得的2～3代HAECs種植在去上皮的兔角膜基質(zhì)片上，在每個(gè)基質(zhì)片上種植(0.5～1.0)×105個(gè)細(xì)胞。置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行浸泡培養(yǎng)。1～2 d后移入插入式培養(yǎng)皿加入適量培養(yǎng)液，使角膜基質(zhì)片與培養(yǎng)液接觸，上皮細(xì)胞與空氣接觸，進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)，隔天換液，連續(xù)14 d。(2)空白對(duì)照組，該組除角膜基質(zhì)片上不種植HAECs外其培養(yǎng)方式與實(shí)驗(yàn)組完全相同。

2.4體外構(gòu)建的復(fù)層上皮組織的觀察與檢測(cè)

2.4.1定期于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況 氣液界面培養(yǎng)14 d進(jìn)行HE染色檢測(cè)。

2.4.2掃描電子顯微鏡觀察 標(biāo)本用2.5%戊二醛固定，PBS 液漂洗，1%鋨酸固定， 乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點(diǎn)真空干燥，BAL - TEC 離子濺射后， 應(yīng)用Philips公司ESEM-30 掃描電鏡進(jìn)行觀察。

2.4.3透射電鏡觀察 組織塊標(biāo)本用2.5%戊二醛固定24 h，1%鋨酸后固定2 h，乙醇梯度脫水，再經(jīng)醋酸異戊酯置換、包埋液滲透、EPON 包埋后，超薄切片，應(yīng)用Philips公司TECANAI-10 透射電鏡進(jìn)行觀察。

2.4.4免疫組織化學(xué)檢測(cè) 體外培養(yǎng)的復(fù)層上皮組織采用10%甲醛固定。然后進(jìn)行小鼠抗人CK3/CK12 單克隆抗體免疫組織化學(xué)鑒定，以正常角膜組織作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。切片脫蠟至水；新鮮配制的3%H2O2室溫處理5～10 min，滅活內(nèi)源性酶； 0.5% Triton X-100打孔；滴加復(fù)合消化液，室溫10 min；滴加正常血清封閉液，室溫20 min；滴加1∶100稀釋的小鼠抗人CK3/12單抗(Ⅰ抗)，4 ℃過(guò)夜，PBS洗2 min×3次；滴加生物素化兔抗小鼠IgG (Ⅱ抗)，37 ℃ 20 min，PBS洗2 min ×3次；滴加抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液，37℃作用30min，PBS沖洗5 min ×5次；DAB顯色，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染；脫水，透明，封片。

結(jié) 果

1倒置顯微鏡下觀察生物學(xué)特性

原代培養(yǎng)24 h后大部分細(xì)胞貼壁，剛貼壁的細(xì)胞呈圓形，折光性強(qiáng)，隨后細(xì)胞胞質(zhì)逐漸展開(kāi)，折光性減弱。細(xì)胞貼壁3 d后生長(zhǎng)迅速，增殖明顯，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。5～7 d左右形成單層，細(xì)胞融合成片，呈膜狀生長(zhǎng)。細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，輪廓清晰，胞漿豐富，胞核呈圓形、卵圓形，見(jiàn)圖1。

Figure 1. Primary HAECs (inverted microscope, ×100).

圖1原代培養(yǎng)的人羊膜上皮細(xì)胞

將培養(yǎng)擴(kuò)增的HAECs接種在制備的角膜基質(zhì)片上， 2～ 4 h細(xì)胞即貼附于基質(zhì)片上， 爾后細(xì)胞逐漸伸展成多角形，1～2 d融合成片，形成單層上皮細(xì)胞，見(jiàn)圖2。

Figure 2. HAECs formed a monolayer on the corneal stroma (HE staining,×100).

圖2人羊膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)上形成單層

2體外構(gòu)建的復(fù)層上皮組織學(xué)檢測(cè)

常規(guī)HE染色的組織切片顯示：形成單層的上皮細(xì)胞在插入式培養(yǎng)皿中進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)14 d，可形成復(fù)層上皮。體外培養(yǎng)的角膜組織由角膜基質(zhì)層和復(fù)層的上皮細(xì)胞組成，共4～5 層上皮細(xì)胞貼附于角膜基質(zhì)上，接觸角膜基質(zhì)的上皮細(xì)胞呈立方形或柱狀，表層上皮細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀，見(jiàn)圖3，與正常角膜上皮相似，見(jiàn)圖4。而空白對(duì)照組上無(wú)任何上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，見(jiàn)圖5。

Figure 3. HAECs formed 4 to 5 layers of cells on the corneal stroma(HE staining,×200).

圖3人羊膜上皮細(xì)胞在角膜基質(zhì)上形成復(fù)層

Figure 4. Normal rabbit cornea(HE staining,×200).

圖4正常兔角膜

Figure 5. The control group without corneal epithelial cells on the stroma(HE staining,×200).

圖5空白對(duì)照組角膜基質(zhì)片上無(wú)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)

3復(fù)層上皮組織的超微結(jié)構(gòu)觀察

3.1掃描電鏡下見(jiàn)角膜基質(zhì)上生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞呈多角形，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間伸出足突連接，體形飽滿，立體感強(qiáng)，表面有豐富的微絨毛，細(xì)胞呈疊層生長(zhǎng)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. A wealth of microvilli on the surface of HAECs(SEM,×4 000).

圖6羊膜上皮細(xì)胞表面有豐富的微絨毛

3.2透射電鏡下見(jiàn)上皮細(xì)胞含豐富的細(xì)胞器，細(xì)胞核呈橢圓形，核膜清晰，基底層細(xì)胞較表層細(xì)胞高大，細(xì)胞間可見(jiàn)橋粒連接，見(jiàn)圖7。

Figure 7. Desmosomes (arrows indicated) formed among HAECs(TEM,bar=0.5 μm).

圖7上皮細(xì)胞之間橋粒形成

4免疫組織化學(xué)檢測(cè)

抗CK3/12 單克隆抗體免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示角膜基質(zhì)上培養(yǎng)的HAECs以及作為陽(yáng)性對(duì)照的正常兔角膜上皮細(xì)胞都有棕黃色顆粒表達(dá)，即細(xì)胞正常表達(dá)角膜上皮特異性CK3/12，見(jiàn)圖8；而陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)，胞漿里無(wú)棕黃色顆粒，只見(jiàn)襯染的核呈紫藍(lán)色(結(jié)果未顯示)。

討 論

角膜緣干細(xì)胞位于角膜緣上皮基底層，具有分化程度低、生命周期長(zhǎng)、高度增生潛能、自我更新的能力，是角膜上皮細(xì)胞增殖和分化的源泉。Pellegrini 等[1]以治療性親水的軟性角膜接觸鏡為載體種植體外擴(kuò)增的自體角膜緣干細(xì)胞，成功治療了角膜緣干細(xì)胞缺陷性眼表疾病。角膜緣干細(xì)胞是眼表重建最理想的種子細(xì)胞，但這種方法不可避免要對(duì)供體眼造成損傷，且由于角膜緣干細(xì)胞的重要性及數(shù)量有限，很難獲得足夠數(shù)量的自體角膜緣干細(xì)胞。對(duì)于因各種疾病及理化因素導(dǎo)致雙眼角膜緣干細(xì)胞缺損，則無(wú)自體角膜緣干細(xì)胞可供利用。因此需要尋找可替代角膜緣干細(xì)胞功能的種子細(xì)胞來(lái)重建眼表。

Figure 8. Positive expression of CK3/12 in HAECs cultured on rabbit corneal stroma for 14 d (immunohistochemical staining,×200).

圖8hAECs在兔角膜基質(zhì)片上培養(yǎng)14d，誘導(dǎo)后的上皮細(xì)胞CK3/12呈陽(yáng)性表達(dá)

細(xì)胞能經(jīng)受一種上皮細(xì)胞型到另外一種上皮細(xì)胞型的轉(zhuǎn)化，這種現(xiàn)象在上皮細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域已被廣泛接受[4]。HAECs位于羊膜的最內(nèi)層，HAECs在受精后第8 d從外胚葉發(fā)育而來(lái)，使其可能維持原腸胚形成前期胚胎干細(xì)胞的可塑性[1]。HAECs不表達(dá)HLA-A、B、C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反應(yīng)[2]。此外，HAECs被認(rèn)為即使在異體移植術(shù)后也有相對(duì)抵抗排斥反應(yīng)的能力，因?yàn)镠AECs表達(dá)免疫抑制因子如CD59[5]和可溶性HLA-G[6]。HAECs擁有和胚胎干細(xì)胞同樣的表面標(biāo)記蛋白，也擁有oct-4和Nanog基因[2]，這兩個(gè)基因是使細(xì)胞保持分化潛力的關(guān)鍵基因。HAECs能在不同微環(huán)境和生長(zhǎng)因子的調(diào)控下，分化成肝細(xì)胞[7]、神經(jīng)元細(xì)胞[8]、毛囊和皮膚上皮細(xì)胞[4]，HAECs理論上可以分化成各種組織細(xì)胞[2]。Parmar等[9]將HAECs種植在角膜膠原罩上治療持續(xù)性角膜上皮缺損，取得了良好的效果。Fatimah通過(guò)對(duì)HAECs的體外分化能力、免疫型、上皮細(xì)胞基因表達(dá)及免疫細(xì)胞化學(xué)分析，認(rèn)為HAECs具有上皮干細(xì)胞的特征，具有分化為角膜上皮細(xì)胞的能力[10]。李瑋等[11]研究發(fā)現(xiàn)體外構(gòu)建的維蛋白支架與羊膜上皮細(xì)胞有組織相容性，纖維蛋白支架可能作為人羊膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)載體和胎膜破口的修復(fù)材料。趙芳等[12]則通過(guò)纖維蛋白膠為載體構(gòu)建組織工程HAECs植片的實(shí)驗(yàn)表明HAECs可能應(yīng)用于眼表重建。

我們?cè)O(shè)想HAECs能在角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)下分化為角膜樣上皮細(xì)胞，并構(gòu)建組織工程角膜表層。實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)擴(kuò)增的HAECs能在去除上皮細(xì)胞的角膜基質(zhì)上較好地黏附生長(zhǎng)并增殖，形成4～5層復(fù)層上皮，基底細(xì)胞呈柱狀或立方形，表層細(xì)胞呈扁平上皮細(xì)胞狀。上皮細(xì)胞之間有橋粒連接形成，并在角膜基質(zhì)上形成復(fù)層上皮組織，組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)與生理?xiàng)l件下角膜上皮極為相似，而且表達(dá)CK3/12。目前認(rèn)為CK3/12是角膜上皮細(xì)胞表達(dá)的特異性標(biāo)志角蛋白，正常情況下HAECs并不表達(dá)CK3/12。據(jù)此可以推測(cè)誘導(dǎo)分化后的HAECs表達(dá)了角膜上皮細(xì)胞的部分功能，HAECs在角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)下可以分化為角膜樣上皮細(xì)胞。

不同組織的微環(huán)境成分不同，細(xì)胞的分化和發(fā)育與其所處的微環(huán)境密切相關(guān)。角膜基質(zhì)是角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)分化重要的微環(huán)境，角膜基質(zhì)具有誘導(dǎo)其表面的非角膜細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化的能力[13]。體外實(shí)驗(yàn)顯示，角膜基質(zhì)也可以誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜上皮細(xì)胞[14]。皮膚干細(xì)胞[15]、毛囊干細(xì)胞[16]在角膜基質(zhì)的誘導(dǎo)下也可以分化為角膜上皮細(xì)胞。我們利用角膜基質(zhì)作為載體誘導(dǎo)HAECs分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標(biāo)志蛋白CK3/12的表達(dá)上均類似角膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞。這進(jìn)一步證明角膜基質(zhì)微環(huán)境在調(diào)控角膜上皮細(xì)胞的分化過(guò)程中起重要作用。

本實(shí)驗(yàn)表明HAECs在角膜基質(zhì)的調(diào)控下可向角膜上皮細(xì)胞分化，HAECs可能是角膜上皮組織工程重建的一種潛在的種子細(xì)胞。

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Reconstructionofcornealepitheliumbyhumanamnioticepithelialcellsculturedinvitro

LIU Xiao-yong1, CHEN Jian1, ZHOU Qing1, WU Jing2, WANG Yan-ping3, JIN Ling4, XU Jing-tang2, HE Chun-xiang1, YAO Min1

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofOphthalmology,SchoolofMedicine，3DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510630,China;4DepartmentofOphthalmology,People’sHospitalofBao’anDistrict,Shenzhen518101,China.E-mail:drchenj@163.com)

AIM: To investigate the plasticity of human amniotic epithelial cells induced to differentiate into corneal epithelial cells and the feasibility of corneal epithelium reconstruction.METHODSA piece of amniotic membrane taken from an uncomplicated elective caesarean section was digested by collagenase, trypsin and EDTA. The amniotic epithelial cells were primarily cultured and passaged in Dulbecco’s modified Eagle’s medium containing 10% fetal bovine serum. The HAECs of the 2nd or 3rd generation were continuously cultured on fresh corneal stroma. One or two days later, the human amniotic epithelial cells formed a monolayer, and then the air-lifting cultivation was carried out in an insert culture dish. The cultured cells on corneal stroma were investigated morphologically by hematoxylin-eosin staining,and its ultramicrostructure was studied by scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Meanwhile, the expression of cytokeratin (CK)3/12 was detected by immunohistochemistry.RESULTSHuman amniotic epithelial cells were successfully reproduced on corneal stromainvitro. The monolayer was formed after cultured for 1 or 2 days, and stratification with 4 to 5 layers of epithelial cells was observed 14 days after air-lifting cultivation. A wealth of microvilli on the surface of HAECs were observed by SEM,while desmosomes among HAECs were found by TEM.The stra-tified cells expressed CK3/12. The composed tissue was very similar to normal corneal epithelium.CONCLUSIONHuman amniotic epithelial cells can be used as seed cells to reconstruct the corneal epithelium by the technique of tissue engineering.

Amnion; Cornea; Epithelial cells; Tissue engineering

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.019