銀杏苦內酯B對N-甲基-N-亞硝脲誘導的大鼠視網膜細胞凋亡的抑制作用*

孟 晶， 張 旭， 陳青山， 張日佳， 丁小燕

(暨南大學 1附屬第一醫院眼科，2醫學院流行病學教研室，廣東 廣州 510632；3中山大學中山眼科中心，廣東 廣州 510060)

1000-4718(2012)04-0694-06

2011-12-09

2012-03-02

廣東省醫學科研基金資助項目 (No.B2009125)；建設中醫藥強省科研課題(No.2010363)；廣東省科技計劃項目(No.2011B031700045)

△通訊作者 Tel：020-38688116；E-mail:zqz1999@tom.com

銀杏苦內酯B對N-甲基-N-亞硝脲誘導的大鼠視網膜細胞凋亡的抑制作用*

孟 晶1△， 張 旭1， 陳青山2， 張日佳1， 丁小燕3

(暨南大學1附屬第一醫院眼科，2醫學院流行病學教研室，廣東 廣州 510632；3中山大學中山眼科中心，廣東 廣州 510060)

目的探討銀杏苦內酯B(GB)對N-甲基-N-亞硝脲(MNU)誘導的大鼠視網膜變性的影響及其機制。方法建立大鼠視網膜變性模型，應用TUNEL法檢測光感受器細胞凋亡，RT-PCR法和免疫組織化學法分別檢測MNU作用后不同時間大鼠視網膜中bcl-2和bax mRNA和蛋白的表達。結果GB治療組外核層細胞凋亡指數顯著低于模型組(P<0.01)。MNU作用后12 h、1 d、2 d、3 d和5 d，bcl-2/bax mRNA模型組為0.36、0.15、0.29、0.42和0.64，GB治療組為0.98、0.92、0.53、0.45和0.68，顯著高于模型組(P<0.01)。GB治療組Bcl-2蛋白在MNU給藥后1 d表達最強，2 d陽性表達下降，3 d后陽性表達消失，模型組未見視網膜Bcl-2陽性表達；GB治療組Bax蛋白表達顯著低于模型組(P<0.01)。結論銀杏苦內酯B能抑制MNU誘導的視網膜光感受器細胞凋亡，可能與上調Bcl-2的表達量，提高Bcl-2/Bax比值有關。

N-甲基-N-亞硝脲； 銀杏苦內酯B； 視網膜； 細胞凋亡； 光感受器細胞

銀杏苦內酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏苦葉提取物中的主要的活性成分。已有研究[1-2]證實GB通過上調Bcl-2/Bax比值，劑量依賴性對抗谷氨酸興奮性毒性，保護體外培養的視網膜神經細胞，并對N-甲基-N-亞硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)誘導的實驗性大鼠視網膜變性所致的大鼠視網膜光感受器細胞損傷和視功能損害具有抑制作用。但GB在體內的作用尚缺乏研究。本研究擬用免疫組化方法及RT-PCR法檢測MNU作用不同時間大鼠視網膜中Bcl-2和Bax的表達水平，旨在探討GB對MNU誘導的大鼠視網膜變性的影響及作用機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 SD大鼠26只，生后46 d，雌雄不拘，由中山大學實驗動物中心提供，許可證號為粵監證字2004A089。全部動物飼養在標準鼠籠內，維持12 h白晝、12 h夜晚的時間周期。

1.2試劑和藥物 GB購自廣州市藥檢所；MNU購自Sigma；蛋白酶K購自Merck；InSituCell Death Detection Kit試劑盒購自Roche Applied Science；Bcl-2及Bax羊抗大鼠單克隆抗體購自Santa Cruz；caspase-3兔抗羊多克隆抗體、即用型SABC試劑盒和二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒均購自博士德公司；焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)處理水購自威佳生物有限公司。DEPC購自上海生工生物工程有限公司；TrizolTM購自Invitrogen Life Technologies；DNase I購自Pharmacia；RNA提取用耗材需經如下處理：0.1%DEPC溶液浸泡過夜，121 ℃高溫高壓30 min，以除去DEPC。100 bp DNA Ladder及2×Taq Platinum PCR MasterMix購自北京天為時代生物技術有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Fermentas；引物由北京賽百盛基因技術有限公司合成，序列如下：bcl-2(274 bp)正義鏈5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3' ，反義鏈5'-TAGTTCCACAAAGGCATCCC-3'；bax(301 bp)正義鏈5'-TGGCGATGAACTGGACAACAAC-3' ，反義鏈5'-CCCGAAGTAGGAAAGGAGGC-3'；內參照β-actin(660 bp)正義鏈5'-CCAACCGTGAAAAGATGACC-3'，反義鏈5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'。

1.3儀器 倒置相差顯微鏡(Leica)；高速離心機(蘇州凈化設備廠)；生物和光學顯微鏡(Olympus)，直流穩壓電泳儀(北京)；IBAS 2.0全自動圖像分析系統(Kontron)；PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像分析系統(Vilber Lourmat)；彩色圖像攝錄輸入儀(JVKky-F30B-CCD)。

2方法

2.1動物模型的建立 生后46 d的SD大鼠26只，隨機分為A：正常對照組(6只)；B：模型組(10只)；C：GB治療組(10只)。GB治療組于生后46 d GB 40 mg/kg灌胃給藥，模型組給等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續灌服7 d，并于生后第50 d將B、C組分別按體重一次性腹腔注射MNU 40 mg/kg，建立大鼠視網膜變性模型。各組每次2只分別于腹腔注射MNU后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d處死動物，取1只大鼠眼球做病理切片，另1只分離出視網膜提取RNA。

2.2TUNEL檢測細胞凋亡[1]檢測方法同文獻[1]。

2.3RT-PCR檢測視網膜Bcl-2和Bax mRNA的表達水平 總RNA的提取：將50～100 mg視網膜組織放入DEPC處理過的研缽中，加入液氮后將組織研碎，加入1 mL Trizol，勻漿；加0.2 mL氯仿搖勻，4 ℃12 000 r/min離心15 min；水相移至新管，加0.5 mL的異丙醇，4 ℃ 12 000 r/min離10 min；棄上清，加75%乙醇1 mL清洗，4 ℃ 7 500 r/min離心5 min，棄上清。真空干燥后，用DEPC處理過的ddH2O溶解沉淀。取1 μL RNA樣品，檢測其在260 nm和280 nm處的吸光度值比，確定其質量、濃度；取1 μL RNA進行瓊脂糖電泳，檢測RNA的完整性，其余的總RNA保存于-80 ℃備用。

使用RT試劑盒以RNA為模板反轉錄為cDNA。將cDNA分裝，-20 ℃凍存待用。以cDNA為模板，加入引物等進行PCR反應，主要反應條件如下：bcl-2 60 ℃退火30 s，循環30次，PCR產物274 bp；bax 60 ℃退火30 s，循環30次，PCR產物301 bp；內參照β-actin 60 ℃退火30 s，循環30次，PCR產物660 bp。PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統顯帶，拍照。

凝膠的顯影結果經全自動圖像分析系統處理，計算每個目的條帶的積分吸光度值，計算bcl-2和bax與β-actin積分吸光度值的比值，得出bcl-2和bax相對于β-actin mRNA的表達量(bcl-2、bax/β-actin)，實驗重復3次。

2.4免疫組織化學染色 免疫組織化學染色方法同第二部分。計數方法：采用Kontron IBAS 2.0圖像分析系統進行數據處理。400倍鏡下，自視盤旁開始向鋸齒緣方向連續取4個視野，記錄每個視野中免疫組化陽性細胞數，取每個樣本的平均值進行分析。

3統計學處理

結 果

1大鼠視網膜細胞的凋亡情況

正常組大鼠視網膜內未見凋亡細胞核。模型對照組MNU作用1 d，視網膜外核層出現TUNEL陽性細胞核，2 d時大量增多，達高峰，隨后逐漸減少，5 d時仍見少量TUNEL陽性細胞核。GB 40 mg/kg治療組與模型組比較外核層細胞凋亡指數有顯著差異(P<0.01)，見圖1、表1。GB 40 mg/kg治療組在MNU造模后5 d時未見TUNEL陽性細胞核。

Figure 1. The photoreceptor cell apoptosis was detected by TUNEL(×200).A，B，C：retina from MNU group at 1 d，2 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection;D，E，F： retina from GB group at 1 d，2 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖1TUNEL法檢測視網膜細胞凋亡

表1各組大鼠視網膜外核層細胞凋亡指數

Group1d2d3d5d7dControl0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0MNU22.4±5.338.8±3.514.0±5.66.8±4.30.0±0.0GB+MNU14.0±5.6**25.5±5.0**7.9±2.8**0.0±0.0**0.0±0.0**

**P<0.01vsMNU group.

2視網膜bcl-2和baxmRNA的表達水平

如圖2所示，正常對照組可檢測到bcl-2 mRNA的表達。 模型對照組MNU作用后12 h視網膜bcl-2 mRNA表達量下降，第1 d降至最低，表達量約低至正常的1/4，此后開始回升。GB治療組在MNU處理12 h時，bcl-2 mRNA的表達升高，高于正常的2倍，24 h時達到最高，此后漸下降，第3 d降低最顯著，第5 d時又開始回升，見表2。

如圖2所示，正常組可檢測到bax mRNA的表達。模型組MNU腹腔注射后12 h視網膜bax mRNA表達量上升，第2 d升至最高，表達量約至正常的9倍，此后開始下降，第5 d時仍為正常的5倍。GB治療組在MNU處理12 h時，bax mRNA的表達升高，高于正常，第2 d升至最高，表達量約至正常的6倍，此后漸下降，第5 d時仍為正常的4倍，見表3。

模型對照組12 h、1 d、2 d、3 d和5 d時bcl-2/bax比值為0.36、0.15、0.29、0.42和0.64。GB治療組在MNU處理12 h、1 d、2 d、3 d和5 d時，bcl-2/bax比值分別為0.98、0.92、0.53、0.45和0.68，均高于模型組。

3免疫組織化學染色

正常對照組視網膜各層均未見Bcl-2和Bax蛋白陽性表達。模型對照組1 d后，視網膜外核層可見Bax陽性表達，2 d時表達最強，此后逐漸表達減弱，5 d時仍有少量陽性表達。MNU處理組各時點均未見視網膜Bcl-2陽性表達。

GB治療組Bcl-2在1 d表達最強，2 d陽性表達下降，3 d后陽性表達消失。Bax在2 d表達最強，3 d陽性表達下降，5 d后仍有陽性表達，見圖3、4和表4。

Figure 2. The expression of bcl-2 and bax mRNA in retina at different time points after MNU injection.A：normal control； B～F：retina from GB group at 12 h，1 d，2 d，3 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection； G～K：retina from MNU group at 12 h，1 d，2 d，3 d and 5 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖2各組在不同時間大鼠視網膜bcl-2和baxmRNA表達

表2各組不同時間視網膜bcl-2mRNA表達

Group12h1d2d3d5dControl0.44±0.080.44±0.080.44±0.080.44±0.080.44±0.08MNU0.39±0.090.14±0.080.61±0.110.71±0.120.81±0.19GB+MNU0.98±0.07**1.19±0.26**0.81±0.18**0.48±0.11**0.67±0.18**

**P<0.01vsMNU group.

表3各組不同時間視網膜baxmRNA表達

Group12h1d2d3d5dControl0.25±0.060.25±0.060.25±0.060.25±0.060.25±0.06MNU1.06±0.091.64±0.082.11±0.211.66±0.071.26±0.14GB+MNU1.00±0.11**1.28±0.18**1.54±0.24**1.07±0.13**0.99±0.16**

**P<0.01vsMNU group.

Figure 3. Bcl-2 expression in retina at different time points after MNU injection(immunohistochemical staining,×400). A：normal control；B：retina from MNU group at 1 d after the 40 mg/kg MNU injection；C，D，E：retina from GB group at 1 d,2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖3各組不同時間視網膜Bcl-2的表達

討 論

在研究藥物對光感受器的保護作用機制中采用了TUNEL細胞凋亡檢測法，即DNA斷裂的原位末端標記法。細胞凋亡中，染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的黏性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling, TUNEL)，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用，可檢測出極少量的凋亡細胞[3]。

以往研究結果顯示：正常對照組大鼠視網膜內未見凋亡細胞核。模型對照組1 d時，視網膜外核層出現TUNEL陽性細胞核，2 d時大量增多，達高峰，隨后逐漸減少，5 d時仍見少量TUNEL陽性細胞核。GB 40 mg/kg治療組與模型組比較外核層細胞凋亡指數有顯著差異(P<0.01)，GB 40 mg/kg治療組在MNU造模后5 d時未見TUNEL陽性細胞核。提示GB能抑制MNU誘導的視網膜損傷大鼠的光感受器細胞的凋亡。

Figure 4. Bax expression of retina at different time after MNU injection(immunohistochemical staining,×400).A：normal control；；B，D：Retina form MNU group 2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection；C，E：Retina form GB group at 2 d and 3 d after the 40 mg/kg MNU injection.

圖4各組不同時間視網膜Bax的表達

表4各組不同時間視網膜Bcl-2和Bax蛋白的表達

Protein Group1d2d3d5dBcl-2MNU0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0GB+MNU30.5±3.4**16.1±2.3**0.0±0.00.0±0.0BaxMNU20.1±3.238.6±3.425.8±2.913.2±2.2GB+MNU15.5±2.4**23.8±2.9**10.2±1.9**6.2±1.5**

**P<0.01vsMNU group.

Bcl-2家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，它們的相互作用調節著細胞的存活與凋亡。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進凋亡蛋白，并且Bax是Bcl-2活性的主要調控因子，Bcl-2促進細胞生存，Bax促進細胞死亡，Bcl-2與Bax的比值對于決定細胞是否發生凋亡起決定性作用[4]。

研究認為[5]，細胞色素C等凋亡前體物質是通過線粒體內外膜之間的通透性轉換孔(permeability transition pore，PTP)開放釋放到細胞質中，外界凋亡誘導因素可導致PTP開放，引起線粒體膜電位下降和細胞色素C等釋放。Harris等[6]指出，Bcl-2家族對PTP的開放和關閉起重要調節作用。促凋亡蛋白Bax 可通過與線粒體內膜的腺苷轉位因子(adenine nucleotide translocator，ANT)或外膜的電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)結合介導PTP開放，而抗凋亡蛋白Bcl-2則可通過與Bax競爭性結合ANT，或直接阻止Bax與ANT或VDAC結合介導PTP關閉，而發揮抗凋亡作用。Bax只有形成低聚物才能在線粒體內外膜之間形成孔道并釋放細胞色素C等；Bcl-2可通過阻止Bax在線粒體形成低聚物來發揮其凋亡作用[7，8]。在細胞中Bcl-2和Bax蛋白是以異二聚體的形式存在，阻止Bax插入線粒體外膜，保護線粒體電勢梯度，調節細胞內Ca2+的自穩狀態和氧化還原狀態來抑制凋亡。如果Bcl-2和Bax的表達量相互平衡，形成的Bcl-2/Bax異二聚體占優勢，則細胞的存活期正常；如果Bcl-2過表達而Bax的表達不相應增多，使形成的Bcl-2/Bcl-2同二聚體占優勢，則細胞的存活期延長；如Bax過表達而Bcl-2不相應增多，使形成的Bax/Bax同二聚體占優勢，則發生細胞凋亡[9]。

綜上所述，銀杏內酯B抑制視網膜光感受器細胞的凋亡，與上調Bcl-2的表達量、降低Bax表達、提高Bcl-2/Bax比值有關。

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[2] 孟 晶,丁小燕, 朱曉波,等. 銀杏苦內酯B對體外培養的視網膜神經細胞內鈣離子濃度和線粒體功能的影響[J].中國病理生理雜志, 2009, 25(11):2192 - 2196.

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ProtectivemechanismsofginkgolideBonratretinalcellapoptosisinducedbyN-methyl-N-nitrosourea

MENG Jing1, ZHANG Xu1, CHEN Qing-shan2, ZHANG Ri-jia1, DING Xiao-yan3

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofEpidemiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;3ZhongshanOphthalmicCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,China.E-mail:zqz1999@tom.com)

AIM: To investigate the protective mechanisms of ginkgolide B (GB) on rat retinal degeneration induced byN-methyl-N-nitrosourea (MNU).METHODSThe rat retinal degeneration model was made. Photoreceptor cell apoptosis was measured by TUNEL assay. The expression of Bcl-2 and Bax in the different time points in the rat retina after treated with MNU was measured by RT-PCR and immunohistochemical methods.RESULTSThe outer nuclear layer cell apoptotic index in GB treatment group was significantly lower than that in model group (P<0.01). The bcl-2/bax mRNA ratios at scheduled time points of 12 h, 1 d, 2 d, 3 d and 5 d after MNU injection in model control were 0.36, 0.15, 0.29, 0.42 and 0.64, respectively, while the ratios in GB group were 0.98, 0.92, 0.53, 0.45 and 0.68, respectively, larger than those in model control group (P<0.01). No Bcl-2 positive expression was detected at any scheduled time points after MNU injection in model control group. Strong positive Bcl-2 expression was detected in GB group 1 d after MNU injection, decreased at the 2nd day and disappeared at the 3rd day. Compared with model control group, the Bax expression in GB group was significantly decreased (P<0.01).CONCLUSIONGinkgolide B effectively inhibits the apoptosis of photoreceptor cells. The mechanism of GB action may be related to the increase in the expression of Bcl-2 and the increase in the ratio of Bcl-2/Bax.

N-methyl-N-nitrosourea; Ginkgolide B; Retina; Apoptosis; Photoreceptor cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.04.020