乳香中三萜類成分的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定

佟昕，劉汶，梁曉旭，齊文，潘英妮，華會(huì)明，劉曉秋*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

乳香中三萜類成分的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定

佟昕1，劉汶2，梁曉旭1，齊文1，潘英妮1，華會(huì)明1，劉曉秋1*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；2.沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110000）

目的：以乳香中主要三萜類成分為指標(biāo)，建立和完善乳香的定性定量分析方法。方法：用TLC鑒別法，以三萜酸類成分11-羰基-β-乙酰－乳香酸（AKBA）為對(duì)照品，采用硅膠GF254薄層板，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－冰醋酸（10∶2∶0.2）為展開劑，鑒別乳香藥材中AKBA；用HPLC測(cè)定方法，Agilent TC-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈-0.05%磷酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相，流速：0.8mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm，測(cè)定不同來(lái)源乳香藥材中AKBA和11-羰基-β-乳香酸（KBA）含量。結(jié)果：乳香TLC圖譜中，AKBA斑點(diǎn)清晰、分離效果好；HPLC含量測(cè)定法中，AKBA和KBA分別在0.024 63～0.246 3mg·mL－1和0.010 04～0.100 4mg·mL－1，線性關(guān)系良好。AKBA和KBA的回收率分別為96.1%（RSD＝3.1%）和96.4%（RSD＝3.5%）。結(jié)論：所建立的TLC和HPLC法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為乳香定性、定量的質(zhì)量控制方法。

乳香；三萜類成分；鑒別；含量測(cè)定

乳香（Olibanum）為橄欖科植物卡氏乳香樹Boswellia carteriiBirdw.及同屬植物鮑達(dá)乳香樹Boswellia bhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂。根據(jù)藥材產(chǎn)地不同，被稱為索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香。乳香中主要成分是樹脂、揮發(fā)油、樹膠等［1］，其中樹脂中主要三萜類化合物有11-羰基-β-乳香酸（KBA）、11羰基-β-乙酰乳香酸（AKBA）、β-乳香酸、3-乙酰-β-乳香酸等，具有抗炎、抑制腫瘤、抗菌、抗氧化［2］、抗血小板凝集［3］和免疫抑制［4］等作用。《中國(guó)藥典》2010版（一部）中索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香分別以揮發(fā)油成分α-蒎烯和醋酸辛酯作為鑒別指標(biāo)；以揮發(fā)油總量為含量測(cè)定指標(biāo)，規(guī)定揮發(fā)油含量分別不得低于6.0%和2.0%。文獻(xiàn)報(bào)道以氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［5］鑒定乳香揮發(fā)油成分，以薄層色譜方法鑒別乳香中揮發(fā)性成分［6］。孫磊等［7］、王淳等［8］對(duì)乳香中三萜酸類成分進(jìn)行了含量測(cè)定。筆者研究表明在乳香中AKBA和KBA含量穩(wěn)定，可作為質(zhì)量控制指標(biāo)。為此，建立了乳香中特有三萜類成分AKBA的TLC鑒別法及HPLC同時(shí)測(cè)定AKBA和KBA含量。所建立的方法操作簡(jiǎn)便，分離度高，精密度和準(zhǔn)確度均符合要求，為新版《中國(guó)藥典》乳香質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供依據(jù)。

1 儀器、材料和試劑

ZF-1型三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠），SHIMADZU高效液相色譜儀（日本島津公司，LC-10Atvp泵，DAD檢測(cè)器，Class-vp工作站），AB135-S天平（METTLER TOLEDO儀器有限公司）。硅膠GF254薄層板（自制）。

對(duì)照品AKBA、KBA均為自制（HPLC純度大于98.0%），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1；乙腈色譜純（廣州百靈威試劑公司），純凈水（杭州娃哈哈有限公司），其他試劑均為分析純；乳香樣品No.1～2產(chǎn)自印尼，No.3～10產(chǎn)自埃塞俄比亞，No.11～12產(chǎn)自索馬里，No.13產(chǎn)自印度。經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院王延年副教授鑒定No.1～13為正品，No.14為摻偽品，No.15為偽品。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備 取AKBA對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取乳香樣品100 mg，加甲醇10mL，超聲處理10 min，濾過，濾液作為供試品溶液。

圖1 AKBA和KBA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.1.2 色譜條件和樣品鑒別 分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1μL，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板，以環(huán)己烷－乙酸乙酯 －冰醋酸（10∶2∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（254nm）下觀察。No.1～13供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的暗斑；No.14供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上的斑點(diǎn)輪廓不清晰，Rf值0.6處有雜質(zhì)斑點(diǎn)；No.15供試品色譜中，與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上未見斑點(diǎn)（見圖2）。

圖2 乳香的薄層色譜圖

2.2 AKBA和KBA的HPLC含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（80∶20），檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20μL。該色譜條件下，理論塔板數(shù)按AKBA峰計(jì)算不得小于5 000。AKBA和KBA均達(dá)到基線分離（見圖3）。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取AKBA和KBA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇配制成每1mL含AKBA 0.493 mg，KBA 0.201 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品（No.11）粉末約60 mg，精密稱定，精密加甲醇25mL，密塞，稱定重量。超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖3 對(duì)照品（A）和供試品（B）HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mL置5mL量瓶中，制成系列混合對(duì)照品溶液。分別吸取20μL，注入液相色譜儀，以測(cè)得的峰面積積分值為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品濃度（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，AKBA的回歸方程為Y＝2.655×107X＋2.062×105，r＝0.999 4，表明AKBA在0.024 63～0.246 3 mg·mL－1線性關(guān)系良好。KBA的線性方程為Y＝2.356×107X＋1.494×105，r＝0.999 4，表明 KBA在0.010 04～0.100 4 mg·mL－1線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，AKBA和 KBA濃度分別為 0.098 5 mg·mL－1和0.040 2 mg·mL－1，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，AKBA和 KBA的平均峰面積是2 882 279和1 084 302，峰面積的 RSD分別為1.4%和1.6%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（No.11）粉末6份，按供試品溶液制備方法處理，進(jìn)行測(cè)定，樣品中AKBA和KBA的含量分別為3.80%和1.44%，計(jì)算RSD分別為2.0%和2.4%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（No.11），在制備后0，2，4，6，8 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定色譜峰面積，AKBA和KBA的平均峰面積為2 922 371和876 687，峰面積的RSD分別為0.85%和2.3%。表明供試液制備后8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收率試驗(yàn)方法，取已知含量的樣品（No.11）6份，每份30 mg，分別精密加入 AKBA對(duì)照品溶液（2.472 mg·mL－1）0.5mL和 KBA對(duì)照品溶液（0.924 mg·mL－1）0.5mL。按2.2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 回收率試驗(yàn)

2.2.9 樣品測(cè)定 取13批乳香樣品，按2.2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算AKBA和KBA含量，結(jié)果見表2。

表2 乳香藥材中AKBA和KBA含量測(cè)定／%

3 討論

乳香中含樹脂60%～70%（主要為三萜類化合物）、樹膠20%～30%、揮發(fā)油3%～8%。樹脂中含有大量乳香酸類成分，其中β-乳香酸和3-乙酰-β-乳香酸在不同來(lái)源和批次樣品中含量相差約4倍以上，與文獻(xiàn)中報(bào)道［8］一致，不宜作含量測(cè)定指標(biāo)成分。而AKBA和KBA為乳香主要活性成分［2］，具有明顯的抗炎、抗腫瘤活性，且在分子中有共軛結(jié)構(gòu)，紫外250nm處有最大吸收，含量穩(wěn)定，采用等度洗脫，易于檢測(cè)，適合作為乳香定量檢測(cè)的指標(biāo)成分。建議新版《中國(guó)藥典》以AKBA、KBA兩者之和來(lái)規(guī)定指標(biāo)成分的含量。含量限度值有待累計(jì)更多批數(shù)樣品數(shù)據(jù)后確定。

AKBA與10%硫酸－乙醇溶液和5%香草醛－濃硫酸溶液均無(wú)顯色反應(yīng)，鑒于AKBA具有紫外吸收，故采用硅膠GF254板，觀察其在紫外燈（254nm）下暗斑。考察了石油醚－乙酸乙酯－丙酮、二氯甲烷－甲醇和環(huán)己烷－乙酸乙酯－冰醋酸展開系統(tǒng)，最終選定環(huán)己烷－乙酸乙酯－冰醋酸系統(tǒng)，所得斑點(diǎn)清晰、分離度好，且Rf值適當(dāng)。圖2中No.1～13可見乳香樣品中均有與AKBA Rf值相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，因此，AKBA可作為乳香薄層鑒別的特征性成分。所建立的TLC法，簡(jiǎn)便易行，專屬性強(qiáng)，可對(duì)乳香及摻偽品和偽品進(jìn)行有效鑒別。

在No.14樣品的薄層色譜中，與AKBA Rf值相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)模糊，說(shuō)明含量較低，結(jié)合性狀觀察，表明樣品透明度差，推測(cè)其摻入雜質(zhì)。No.15樣品的薄層色譜中，未見與AKBA Rf值相對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，證明是偽品。將樣品粉末與碘反應(yīng)，正品乳香與碘無(wú)顏色反應(yīng)，而No.14摻偽品和No.15偽品與碘反應(yīng)顯藍(lán)色，推測(cè)可能存在淀粉。

［1］崔征.生藥學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：161-162.

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Qualitative and Quantitative Analysis of Triterpenes in Olibanum by TLC and HPLC

TONG Xin1，LIUWen2，LIANG Xiao-xu1，QIWen1，PAN Ying-ni1，HUA Hui-ming1，LIU Xiao-qiu1
（1.Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China；2.Shenyang Institue for Food and Drug Conctrol，Shenyang 110000，China）

Objective：To establish and improve the qualitative and quantitative analysis of triterpenes in the Olibanum.Methods：TLC was used for qualitative analysis of triterpenes in the Olibanum，silica gel GF254，mixed with sodium carboxymethyl cellulose as the coating substance and cyclohexane-ethyl acetate-glacial acetic acid（10∶2∶0.2）as mobile phase，and triterpene acids composition of Olibanum as reference substance namely acetyl-11-keto-β-boswellic acid（AKBA）.HPLCmethod was used for quantitative analysis of AKBA and 11-keto-β-boswellic acid（KBA），using Agilent TC-C18column（250mm×4.6mm，5μm）.Themobile phasewas amixture of acetonitrile-0.05%phosphoric acid（80∶20）.The flow rate was 0.8mL·min－1.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 250nm.Results：The TLCmethod had high sensitivity and showed clear spots of AKBA.The recoveries of AKBA and KBA by HPLCmethod were 96.1%（RSD＝3.1%）and 96.4%（RSD＝3.5%），respectively.Conclusion：TLC and HPLCmethods are simple，accurate and repeatable.Themethods can be used for the quality control of Olibanum.

Olibanum；Triterpenes；Qualitative；Quantitative analysis

*［通訊作者］劉曉秋，E-mail：liuxiaoqiu3388＠tom.com

2012-03-28）